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    表面等離子共振傳感檢測Cry2A蛋白

    2014-03-08 09:17:57岳喜慶
    食品科學(xué) 2014年24期
    關(guān)鍵詞:金片蒸餾水靈敏度

    蔡 淼,黃 新,岳喜慶,*

    (1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽 110866;2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所,北京 100029)

    表面等離子共振傳感檢測Cry2A蛋白

    蔡 淼1,黃 新2,岳喜慶1,*

    (1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽 110866;2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所,北京 100029)

    目的:建立利用表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)傳感器檢測轉(zhuǎn)基因植物中蘇云金芽孢桿菌Cry2A蛋白的方法。方法:利用SPR檢測技術(shù),根據(jù)生物分子間的相互作用,在金片表面修飾Cry2A蛋白的特異性單克隆抗體,對不同質(zhì)量濃度梯度的Cry2A蛋白進(jìn)行檢測研究。結(jié)果:該方法可有效地檢測到Cry2A蛋白,檢測靈敏度可達(dá)10 ng/mL,與同為抗蟲基因編碼的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。結(jié)論:利用SPR方法檢測Cry2A蛋白操作簡單,省時(shí)且靈敏度高、特異性強(qiáng),可用于對Cry2A蛋白的定性檢測。

    表面等離子共振傳感器;Cry2A蛋白;蘇云金芽孢桿菌;轉(zhuǎn)基因植物

    蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt),是一種分布非常廣泛的革蘭氏陽性病原性細(xì)菌[1],其在芽孢形成時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有殺蟲活性的晶體蛋白質(zhì)[2],稱為殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein,ICP)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Bt基因?qū)胫参镏校牧贾参锲贩N,使改良后的植物具有抗蟲基因,可有效殺滅多種害蟲[3-7]。在節(jié)省害蟲防治成本的同時(shí),還能緩解因大量施用農(nóng)藥而造成的環(huán)境污染。目前已有多種轉(zhuǎn)Bt基因農(nóng)作物實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化種植,如玉米、棉花、馬鈴薯、番茄等[8]。然而,由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問題一直備受關(guān)注,各國對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種植和進(jìn)口都有著嚴(yán)格的規(guī)定,因此研究出一種簡便快捷地檢測轉(zhuǎn)Bt基因作物的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究針對Bt蛋白中的Cry2A蛋白進(jìn)行檢測研究,Cry2A蛋白能同時(shí)殺滅鱗翅目害蟲和雙翅目害蟲。

    表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)技術(shù)是近些年得到長足發(fā)展的一項(xiàng)應(yīng)用于分析生物分子間相互作用的檢測技術(shù)[9-14],而表面等離子共振傳感器便是基于這種技術(shù)的一種光學(xué)傳感器,它利用全反射時(shí)入射光可以和金屬表面的等離子發(fā)生共振的原理,檢測生物分子之間的相互作用與結(jié)合過程以及動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[11,15-18]。相比其他檢測方法,SPR方法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):1)檢測樣品不需標(biāo)記,避免了樣品因?yàn)闃?biāo)記不當(dāng)而失去活性[19-22];2)可做到動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測;3)檢測過程非常簡便且靈敏度高。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品分析、蛋白質(zhì)[23-25]與核酸檢測[26-27]、藥物篩選、臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)便是基于這種技術(shù),利用SPR傳感器對Bt抗蟲蛋白Cry2A進(jìn)行了檢測研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    單側(cè)鍍金玻璃片(12 mm×20 mm,單側(cè)鍍金50 nm)、SPR Navi 200傳感器 芬蘭BioNavis公司;蒸餾水;無水乙醇;30%氨水、30%雙氧水均為分析純;巰基十一酸(11-mercaptoundecanoic acid,11-MUA) Sigma中國上海有限公司;3-巰基丙酸(3-mercaptopropionic acid,3-MPA)、脂肪酸甲酯磺酸鹽(fatty acid methyl ester sulfonate,MES)、N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺(N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(1-hydroxy-5-pyrrolidinedione,NHS)、Cry2A蛋白及其單克隆抗體、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、磷酸鹽(phosphate buffered saline,PBS)緩沖液(20 mmol/L NaH2PO4,150 mmol/L NaCl,pH7.4)、DHG-9030恒溫干燥箱 北京江陰濱江設(shè)備公司;Cry2A蛋白檢測試劑盒 美國Envirlogix公司。

    1.2 方法

    1.2.1 SPR金片預(yù)處理

    將30%氨水、30%雙氧水、蒸餾水按照1∶1∶5的體積比混合,把金片置入其中,于水浴鍋中煮沸,溫度設(shè)置為80~90 ℃,10 min后取出,用蒸餾水及無水乙醇分別清洗金片表面,氮?dú)獯蹈杀砻?,以便用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 SPR金片表面修飾

    將10 mmol/L 3-MPA溶液與10 mmol/L 11-MUA溶液以10∶1的比例混合,把金片鍍金的一面朝上置于其中,浸泡24 h;取出金片,用蒸餾水及無水乙醇沖洗金片并用氮?dú)獯蹈?,于金片表面滴?00 μL EDC(0.4 mol/L),100 μL NHS(0.1 mol/L)(EDC、NHS均用MES溶解)以活化金片表面的硫醇羧基,室溫靜置2 h后用蒸餾水及無 水乙醇清洗金片,氮?dú)獯蹈?,再次滴?00 μL EDC,100 μL NHS,室溫靜置2 h;蒸餾水及無水乙醇清洗并吹干金片,金片表面滴加100 μL Cry2A單克隆抗體溶液(0.2 mg/mL,PBS稀釋),37 ℃恒溫箱中靜置3 h;蒸餾水洗去表面抗體溶液,氮?dú)獯蹈桑? mg/mL PBS稀釋,覆蓋于金片表面,室溫靜置2 h,用蒸餾水將金片表面清洗干凈,吹干,置于PBS中4 ℃保存。

    1.2.3 SPR檢測樣品

    取出金片,用蒸餾水洗凈,氮?dú)獯蹈桑瑢⒔鹌湃隨PR傳感器的指定位置中,打開儀器和監(jiān)測軟件,通入PBS(使用前需超聲),流速為10 μL/min,待反應(yīng)池及棱鏡溫度達(dá)到設(shè)置溫度后進(jìn)行初始角度掃描(一般將反應(yīng)溫度設(shè)置為低于室溫1~2 ℃),找到固定角后進(jìn)行固定角掃描,待基線穩(wěn)定后,用進(jìn)樣注射器注入300 μL待測樣品溶液(PBS稀釋),通過SPR檢測軟件實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)過程。

    1.2.4 酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測Cry2A蛋白

    將Cry2A標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋到目標(biāo)質(zhì)量濃度,取100 μL加入到樣品板中,室溫靜置15 min,加入100 μL酶標(biāo)抗體,室溫孵育1 h,傾去反應(yīng)液,拍干,吐溫-PBS緩沖液(tween PBS,PBST)洗滌3 次,加入100 μL底物,靜置30 min,最后加入100 μL終止液,使用酶標(biāo)儀讀數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SPR檢測Cry2A蛋白的靈敏度

    將待測抗原Cry2A稀釋成不同質(zhì)量濃度(10~1 000 ng/mL),每種質(zhì)量濃度在同一條件下重復(fù)檢測3 次,對結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算平均值,結(jié)果如圖1所示。進(jìn)樣后約30 s開始產(chǎn)生響應(yīng),表明待測樣品流經(jīng)金片表面時(shí)與結(jié)合在金片表面的單抗發(fā)生特異性結(jié)合,引起金片表面折射率的變化,使SPR角度發(fā)生偏移。樣品質(zhì)量濃度越高,響應(yīng)值越大,說明結(jié)合在金片表面的抗原越多。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,使用SPR檢測Cry2A蛋白的最低檢測限為10 ng/mL。

    圖1 SPR檢測Cry2A蛋白的靈敏度Fig.1 Sensitivity of SPR for the detection of Cry2A protein

    2.2 SPR檢測Cry2A蛋白的重復(fù)性

    選取4 種不同質(zhì)量濃度的Cry2A蛋白重復(fù)檢測3 次,表1結(jié)果顯示每次檢測都有明顯的反應(yīng),且同一質(zhì)量濃度的響應(yīng)值差異很小,隨蛋白質(zhì)量濃度的降低反應(yīng)響應(yīng)值也相應(yīng)減小,表明SPR檢測Cry2A的重復(fù)性較好。

    表1 SPR檢測Cry2A蛋白的重復(fù)性Table 1 Repeatability of SPR for the detection of Cry2A protein

    2.3 SPR檢測Cry2A蛋白的特異性

    為了驗(yàn)證SPR檢測Cry2A蛋白的特異性,選用另外兩種抗蟲Bt蛋白Cry1Ac和Cry2Ab作為對照,3 種蛋白均以1 μg/mL質(zhì)量濃度進(jìn)樣,進(jìn)行3 次特異性檢測實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示,Cry2A蛋白有明顯響應(yīng),而Cry1Ac和Cry2Ab蛋白則未出現(xiàn)明顯響應(yīng),由此可見此方法檢測Cry2A蛋白具有較好的特異性。

    圖2 SPR檢測Cry2A蛋白的特異性Fig.2 Specificity of SPR for the detection of Cry2A protein

    2.4 ELISA法檢測Cry2A蛋白

    使用Cry2A檢測試劑盒對不同質(zhì)量濃度的Cry2A抗原進(jìn)行了檢測,每個(gè)質(zhì)量濃度3 個(gè)重復(fù),結(jié)果如表2所示。陰性樣品的OD值一般不超過0.2,超過0.2均視為陽性樣品,故ELISA法檢測Cry2A蛋白的靈敏度可達(dá)10 ng/mL,與SPR方法靈敏度相當(dāng),但SPR方法具有免標(biāo)記、操作簡便、快捷的優(yōu)勢。

    表 2 ELISA 檢測CCrryy22AA蛋白靈敏度Table 2 Sensitivity of ELISA for the detection of Cry2A protein

    3 討論與結(jié)論

    轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全問題一直備受關(guān)注,我國政府高度重視轉(zhuǎn)基因植物安全檢測工作。因此,對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測新方法的研究具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。SPR傳感器是近年來迅速發(fā)展起來的新型檢測儀器。近30a來,SPR傳感器在技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用領(lǐng)域等方面都有很大的進(jìn)步,現(xiàn)已成為一種檢測生物分子間相互作用的核心手段,且SPR檢測金片可反復(fù)使用30 次左右,降低了實(shí)驗(yàn)成本。但SPR技術(shù)在靈敏度、多通道檢測等方面還有不足。在靈敏度方面目前SPR技術(shù)還無法準(zhǔn)確檢測到一些低濃度、小分子質(zhì)量的分子。在實(shí)現(xiàn)多通道檢測方面,目前SPR傳感器僅可同時(shí)檢測兩組數(shù)據(jù)。以上兩方面問題將是今后SPR檢測研究的主要方向。本實(shí)驗(yàn)基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理,運(yùn)用SPR檢測技術(shù),研究建立了Cry2A蛋白的新的檢測方法。該方法檢測靈敏度可達(dá)10 ng/mL,與傳統(tǒng)的ELISA檢測方法靈敏度相似,但SPR方法具有免標(biāo)記、實(shí)時(shí)監(jiān)測、操作省時(shí)簡便等優(yōu)勢,且特異性較好,在與Cry1Ac和Cry2Ab蛋白的對照檢測中可看出,Cry1Ac和Cry2Ab蛋白未出現(xiàn)明顯響應(yīng),而Cry2A蛋白響應(yīng)明顯。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此方法具有較好的穩(wěn)定性,可實(shí)現(xiàn)對Cry2A蛋白的定性檢測,為Bt蛋白的檢測提供了一種新的可行性方法。

    [1] 李海濤, 姚江, 郭巍, 等. 蘇云金芽孢桿菌Cry2Aa基因的克隆、表達(dá)與活性[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2005, 13(6): 787-791.

    [2] LEE M K, PAUL M, CHEN J S. Brush border membrane binding properties of Bacillus thuringiensis Vip3A toxin to Heliothis virescens and Helicoverpa zea midguts[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 339(4): 1043-1047.

    [3] 徐雪亮, 韓宇, 吳剛. 轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac, cry1C, cry2A基因水稻對田間稻縱卷葉螟及其捕食類天敵的影響[J]. 中國科學(xué): 生命科學(xué), 2011, 41(11): 1095-1104.

    [4] 常雪, 王偉, 沈志成, 等. 轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj玉米對亞洲玉米螟的抗性評(píng)價(jià)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2013, 40(4): 339-344.

    [5] 張嵐, 林克劍, 李飛, 等. 轉(zhuǎn)cry1C和cry2A不同抗蟲基因水稻品種對非靶標(biāo)害蟲灰飛虱生物學(xué)特性的影響[J]. 植物保護(hù), 2011, 37(6): 120-125.

    [6] SHARON D, ROD M. Evolution ecology and management of resistance in Helicoverpa spp. to Bt cotton in Australia[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2012, 110(3): 281-286.

    [7] LU Qiong, CAO Guangchun, ZHANG Lili, et al. The binding character of cry insecticidal proteins to the brush border membrane vesicles of Helicoverpa armigera, Spodoptera exigua, Spodoptera litura and Agrotis ipsilon[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2013, 12(9): 1598-1605.

    [8] MANN R S, GILL R S, DHAWAN A K, et al. Relative abundance and damage by target and non-target insects on Bollgard and BollgardII cotton cultivars[J]. Crop Protection, 2010, 29(8): 793-801.

    [9] KANG C D, LEE S W, PARK T H, et al. Performance enhancement of real-time detection of protozoan parasite, Cryptosporidium oocyst by a modified surface plasmon resonance (SPR) biosensor[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(3): 387-390.

    [10] CHEN X, PAN M, JIANG K. Sensitivity enhancement of SPR biosensor by improving surface quality of glass slides[J]. Microelectronic Engineering, 2010, 87(5/6/7/8): 790-792.

    [11] CHUNG J W, KIM S D, BERNHARDT R. Application of SPR biosensor for medical diagnostics of human hepatitis B virus (hHBV) [J]. Sensors and Actuators B, 2005, 111/112(11): 416-422.

    [12] PARK M, JOACHIM J, PYUN J C. SPR biosensor by using E. coli outer membrane layer with autodisplayed Z-domains[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2011, 154(2): 82-88.

    [13] WANG Jing, SONG Daqian, WANG Liying, et al. Design and performance of immunoassay based on SPR biosensor with Au/Ag alloy nanocomposites[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2011, 157(2): 547-553.

    [14] ZHANG Hua, SUN Ying, WANG Jing, et al. Preparation and application of novel nanocomposites of magnetic-Au nanorod in SPR biosensor[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2012, 34(1): 137-143.

    [15] MARIOTTI E, MINUNNI M, MASCINI M. Surface plasmon resonance biosensor for genetically modified organisms detection[J]. Analytica Chimica Act, 2002, 453(2): 165-172.

    [16] CHABOT V, MIRON Y, CHARETTE P G, et al. Identification of the molecular mechanisms in cellular processes that elicit a surface plasmon resonance (SPR) response using simuLtaneous surface plasmon-enhanced fluorescence (SPEF) microscopy[J]. Biosens Bioelectron, 2013, 50(15): 125-131.

    [17] SUN Ying, BI Ning, SONG Daqian, et al. Preparation of titania sol-gel matrix for the immunoassay by SPR biosensor with magnetic beads[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2008, 134(2): 566-572.

    [18] SHIN Y B, KIM H M, JUNG Y W, et al. A new palm-sized surfaceplasmon resonance (SPR) biosensor based on modulation of a light source by a rotating mirror[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2010, 150(1): 1-6.

    [19] KANG C D, LEE S W, PARK T Y, et al. Performance enhancement of real-time detection of protozoan parasite, Cryptosporidium oocyst by a modified surface plasmon resonance (SP R) biosensor[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(3): 387-390.

    [20] MANERA M G, FERREIRO-VILA E, GARCIA-MARTIN J M, et al. Enhanced magneto-optical SPR platform for amine sensing based on Zn p orphyrin dimers[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2013, 182: 232-238.

    [21] CHEN X, PAN M, JIANG K. Sensitivity enhancement of SPR biosensor by improving surface quality of glass slides[J]. Microelectronic Enginee ring, 2010, 87(5/6/7/8): 790-792.

    [22] KAROONUTHAISIRI N, CHARLERMROJ R, MORTON M J, et al. Development of a M13 bacteriophage-based SPR detection using Salmonella as a case study[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2014, 190: 214-220.

    [23] SOTA H, HASEGAWA Y, IWAKURA M. Detection of conformational changes in an immobilized protein using surface plasmon resonance[J]. Analytical Chemistry, 1998, 70(10): 2019-2024.

    [24] MASSARELLI. Computational modeli ng and surface plasmon resonance analyses in the assessment of peptide ligands interacting with fibrin gamma(312-324)epitope[J]. European Journal Medicinal Chemistry, 2009, 44(5): 2128-2134.

    [25] COCHRAN S, LI C P, FERRO V. A surface plasmon resonancebased solution affinity assay for heparan sulfate-binding proteins[J]. Glycoconjugate Journal, 2009, 26(5): 577-587.

    [26] MONTEIRO J P, FERREIRA J, SABAT R G, et al. SPR based biosensor using surface relief grating in transmission mode[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2012, 174: 270-273.

    [27] NAKAMURA K, SAKAGAMI H, ASANUMA-DATE K, et al. Immobilized glycosylated Fmoc-amino acid for SPR: comparative studies of lectin-binding to linear or biantennary dilacNAc structures[J]. Carbohydrate Research, 2013, 382(15): 77-85.

    Using a Surface Plasmon Resonance Sensor for the Detection of Bacillus thuringiensis Cry2A Protein

    CAI Miao1, HUANG Xin2, YUE Xi-qing1,*
    (1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. Institute of Plant Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China)

    Purpose: To establish a method to detect Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2A protein by surface plasmon resonance (SPR) sensor. Methods: By using SPR based on interaction between biomolecules, the monoclonal antibodies specific to the Cry2A protein were modified on the gold surface for the detection of this protein. Results: The detection limit of Cry2A protein was 10 ng/mL by this method without cross-reaction with Cry1Ac or Cry2Ab protein. Conclusion: The SPR method was simple, time-saving, sensitive, specific and applicable for the qualitative detection of Bt Cry2A protein.

    surface plasmon resonance sensor; Cry2A protein; Bacillus thuringiensis; genetically modified plant

    Q31

    A

    1002-6630(2014)24-0201-04

    10.7506/spkx1002-6630-201424038

    2014-01-17

    質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201410014)

    蔡淼(1987—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因檢測。E-mail:779302469@qq.com

    *通信作者:岳喜慶(1966—),男,教授,博士,研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail:yxqsyau@126.com

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