凝膠層析法分離豬股骨降血壓肽及其體外穩(wěn)定性

舒一梅，李 誠(chéng)，付 剛，陳姝娟，何 利，楊 勇，胡 濱，張志清，蘇 趙

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 62 5014）

凝膠層析法分離豬股骨降血壓肽及其體外穩(wěn)定性

舒一梅，李 誠(chéng)*，付 剛，陳姝娟，何 利，楊 勇，胡 濱，張志清，蘇 趙

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 62 5014）

將 豬股骨酶解液超濾分離后，對(duì)分子質(zhì)量小于5 kD的酶解濾液（IC50值 為1.362 mg/mL）進(jìn)行凝膠層析分離，研究洗脫液、流速、上樣量 3 個(gè)因素對(duì) 豬股骨降血壓肽分離純化效果的影響。結(jié)果表明：以去離子水為洗脫液，流速0.6 mL/min，上樣量體積分?jǐn)?shù)1%時(shí)，能夠得到最佳分離效果，其最高活性組分IC50值達(dá)到 0.401 6 mg/mL。研究凝膠層析分離后抑制率最高的組分的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其有較好的耐熱和耐酸堿、耐鹽性，在pH 2～6中有良好的溶解性。

豬股骨酶解液；降血壓肽；凝膠層析；穩(wěn)定性；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶半抑制濃度

降血壓肽是一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制劑，對(duì)高血壓具有一定的防治效果。降血壓肽相對(duì)于化學(xué)降血壓藥物，具有安全性高、消化吸收性強(qiáng)、降血壓效果溫和且對(duì)正常血壓無(wú) 影響、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)[1]。降血壓肽可由植物蛋白[2]、動(dòng)物蛋白[3]及微生物代謝產(chǎn)物[4]等制備。我國(guó)擁有豐富的畜、禽鮮骨資源，回收利用作為下腳料的骨膠原蛋白制備降血壓肽具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

目前關(guān)于降血壓肽的制備[5]有較多的研究，但其分離純化大都未能取得深入的進(jìn)展，難以將降血壓肽推向工業(yè)化生產(chǎn)。降血壓肽分離提純主要采用超濾[6]、層析[7]等方法，豬股骨降血壓肽的分離純化是豬股骨降血壓肽生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟之一。如何將具有降壓效果的豬股骨降血壓肽從豬股骨酶解混合物中分離出來(lái)得到盡可能純的豬股骨降血壓肽，對(duì)其應(yīng)用前景有較大的影響，開(kāi)發(fā)以其為功能因子的保健食品或治療高血壓的藥物具有較高的實(shí)用價(jià)值[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用凝膠層析的方法分離豬股骨降血壓肽。它是一種常用的分離手段，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、不改變樣品生物活性等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬股骨粉 實(shí)驗(yàn)室自制；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（20 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）荷蘭帝斯曼公司；ACE、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL） 美國(guó)Sigma公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Sephadex G-25柱 美國(guó)Bio-Rad公司；超濾管（5 kD） 德國(guó)默克密理博公司；QT-2漩渦混勻器 上海琪特分析儀器有限公司；UV-3200紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Scientz-12型冷凍干燥機(jī)、D-37520型高速冷凍離心機(jī)、JZ15984型移液槍?zhuān)?00～1 000 μL） 美國(guó)Thermo Fisher公司；ULUP-IV-10T型超純水裝置 四川優(yōu)普科技有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海方舟科技有限公司；層析柱（1.6 cm×60 cm） 上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司；BSZ-100型自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠；WLB-78C型恒流泵 浙江新昌國(guó)康儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 豬股骨降血壓肽的制備

按照實(shí)驗(yàn)室前期豬股骨酶解降血壓肽的優(yōu)選條件制備豬股骨降血壓肽，其工藝流程為：新鮮豬股骨→清洗→高壓蒸煮→粉碎→加酶水解→滅酶→離心→上清液→冷凍干燥。酶解條件為：按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的比例加入相應(yīng)比例的蒸餾水，依次按酶活為12 000 U/g加入堿性蛋白酶（調(diào)節(jié)pH 10，58 ℃反應(yīng)7 h），100 ℃沸水浴10 min滅活。再按酶活為6 000 U/g加入木瓜蛋白酶（調(diào)節(jié)pH 6，55 ℃反應(yīng)4.38 h），100 ℃沸水浴10 min滅活。最后按酶活為12 000 U/g加入風(fēng)味蛋白酶（調(diào)節(jié)pH 7.0，53 ℃反應(yīng)4 h），得到豬股骨降血壓肽酶解液[9]。

將酶解液用截留分子質(zhì)量為5 kD的超濾離心管進(jìn)行超濾，得到分子質(zhì)量小于5 kD的組分，測(cè)定其ACE半抑制濃度（half maximal (50%) inhibitory eoncentration，IC50）值，凍干備用。

1.3.2 凝膠層析法分離

Sephadex G-25的分離范圍在分子質(zhì)量5～100 D之間，故選用Sephadex G-25作進(jìn)一步的分離。稱(chēng)取Sephadex G-25 20 g，加入200 mL去離子水，在沸水浴中溶脹2 h，將充分溶脹后的凝膠倒去上層多余的水及細(xì)小顆粒，反復(fù)洗滌2～3 次，放抽氣瓶中抽氣以除去氣泡，備用[10-11]。

凝膠層析分離豬股骨降血壓肽的步驟為：首先用洗脫液平衡柱子，然后上樣，再用洗脫液洗脫[12-13]（每一條件進(jìn)行6 次以上平行實(shí)驗(yàn)，直到每次平行實(shí)驗(yàn)的分離圖譜一致）。收集洗脫液，每管收集2 mL，在214 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每管吸光度。本實(shí)驗(yàn)選擇洗脫液、流速、上樣量（上樣體積以床體積的百分比計(jì)算）3 個(gè)因素進(jìn)行研究。通過(guò)以分離色譜圖，分離組分的ACE抑制活性為指標(biāo)，對(duì)分離效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2.1 不同洗脫液的影響

進(jìn)樣及洗脫液流出速率控制在0.5 mL/min，上樣量為體積分?jǐn)?shù)1%分別采用pH 7.0、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、0.1 mol/L PBS及去離子水為洗脫液。

1.3.2.2 不同流速的影響

采用去離子水為洗脫液，上樣量體積分?jǐn)?shù)1%，洗脫液流出速率分別控制在0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min。

1.3.2.3 不同上樣量的影響

洗脫液流速控制在0.5 mL/min，去離子水為洗脫液，分別進(jìn)樣體積分?jǐn)?shù)1%、1.5%、2%。

1.3.3 豬股骨降血壓肽的穩(wěn)定性

1.3.3.1 豬股骨降血壓肽的熱穩(wěn)定性

取凝膠層析分離后的抑制率最高的組分，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度0.8 mg/mL，并用鹽酸和NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0，分別置于30、40、50、60、70、80、90、100 ℃的水浴中，保溫2 h，然后迅速拿出，取樣檢測(cè)其IC50值，重復(fù)3 次。

1.3.3.2 豬股骨降血壓肽的酸堿穩(wěn)定性

取凝膠層析分離后的抑制率最高的組分，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度0.8 mg/mL（去離子水配制），用適宜的緩沖液分別調(diào)pH值為2、4、6、8、10、12，常溫放置2 h后，冷藏24 h，取樣檢測(cè)其IC50值，重復(fù)3 次。

1.3.3.3 豬股骨降血壓肽耐鹽穩(wěn)定性

取10 mg凝膠層析分離后的抑制率最高的組分，分別溶于0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L NaCl溶液中，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL，室溫放置2 h后，分別取樣液測(cè)定其IC50值，重復(fù)3 次。

1.3.3.4 豬股骨降血壓肽的溶解性

取凝膠層析分離后的抑制率最高的組分，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL（去離子水配制），并以1 mol/L鹽酸和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，并在10 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定其中蛋白質(zhì)含量[14]，重復(fù)3 次。按下式計(jì)算溶解性。

式中：X為上清液中蛋白質(zhì)含量/mg；Y為樣品質(zhì)量/mg。

1.3.4 ACE抑制率的體外測(cè)定

采用紫外分光光度法[15-16]。

1.3.5 IC50值的測(cè)定

將樣品配制成不同的質(zhì)量濃度，分別測(cè)定其ACE抑制率，以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，ACE抑制率為縱坐標(biāo)，繪制圓滑曲線，從曲線中計(jì)算出IC50值。

1.3.6 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用Lowry法蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠層析法對(duì)分離效果的影響

2.1.1 不同洗脫液對(duì)分離效果的影響

圖1 不同洗脫液的洗脫曲線Fig.1 Separation patterns with different elution solvents

由圖1可知，去離子水為洗脫液能得到4 個(gè)峰、而0.05、0.1 mol/L PBS為洗脫液，只能得到3 個(gè)峰，且峰形都不太理想，前2 個(gè)峰未能完全分開(kāi)，且峰形較寬，分離效果較差。因此，采用去離子水為洗脫液較佳。

2.1.2 流速對(duì)分離效果的影響

圖2 不同流速的洗脫曲線Fig.2 Separation patterns at different elution flow rates

由圖2可知，不同流速對(duì)分離效果的影響較大。當(dāng)流速為0.4、0.6 mL/min能得到4 個(gè)峰，且峰形較尖、高。當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，能分離出3 個(gè)峰，但峰形開(kāi)始變的圓、寬，未能完全分開(kāi)。流速增大至1.0 mL/min，只能分離到1 個(gè)寬而低的峰和2 個(gè)很小的峰，分離效果較差。因此為提高分離效率，采用0.6 mL/min作為分離流速。

2.1.3 上樣量對(duì)分離效果的影響

圖3 不同上樣量的洗脫曲線Fig.3 Separation patterns at different sample loadings

由圖3可知，上樣量對(duì)分離效果的影響較小。蛋白過(guò)多過(guò)少都會(huì)導(dǎo)致分離效果不理想，當(dāng)上樣量為體積分?jǐn)?shù)1%、1.5%時(shí)，比體積分?jǐn)?shù)2%上樣量分離圖峰形尖、高。綜合考慮分離效果以及成本問(wèn)題，采用體積分?jǐn)?shù)1%的上樣量最為合適。

2.1.4 確定洗脫條件

綜合以上得出最佳洗脫條件：采用去離子水為洗脫液，上樣量為體積分?jǐn)?shù)1%，洗脫流速為0.6 mL/min。將超濾后小于5 kD的組分冷凍干燥配成一定的蛋白質(zhì)量濃度，按優(yōu)選的最佳分離條件再進(jìn)行多次驗(yàn)證，圖4A為最佳洗脫曲線。在此區(qū)間形成4 個(gè)洗脫峰，平衡各組分的蛋白質(zhì)量濃度后，測(cè)得其中組分2的抑制率最高，見(jiàn)圖4B，其IC50值為0.401 6 mg/mL，表明該分離條件穩(wěn)定可行。

圖4 豬股骨降血壓肽的分離曲線（A）及各組分的IICC5500值（BB）Fig.4 Separation patterns of antihypertensive peptides from porcine femoral collagen and IC50of each component

2.2 豬股骨降血壓肽的體外穩(wěn)定性

2.2.1 豬股骨降血壓肽熱穩(wěn)定性

由圖5可知，豬股骨降血壓肽（組分2）在不同溫度條件下水浴2 h后，其ACE抑制活性差異不顯著（P＞0.05）。但隨著溫度的升高，豬股骨降血壓肽（組分2）的IC50值也在逐漸增大。當(dāng)溫度在20～60 ℃時(shí)豬股骨降血壓肽（組分2）ACE活性變化極?。ú町悾?～0.023 5 mg/mL）；當(dāng)溫度達(dá)到100 ℃時(shí)，其IC50值仍保持在0.610 3 mg/mL以下，具有較高的活性。由此可知，豬股骨降血壓肽（組分2）具有良好的耐高溫性能。

圖5 不同溫度對(duì)豬股骨降血壓肽（組分2）的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of antihypertensive peptides from porcine femoral collagen (peak 2)

2.2.2 豬股骨降血壓肽的酸堿穩(wěn)定性

圖6 不同pH值對(duì)豬股骨降血壓肽（組分2）的影響Fig.6 Effect of pH value on the activity of antihypertensive peptides from porcine femoral collagen (peak 2)

從圖6可知，當(dāng)pH值在2～7之間時(shí)，豬股骨降血壓肽（組分2）的活性變化幅度很?。≒＞0.05），差異不顯著，豬股骨降血壓肽（組分2）的IC50值維持在0.467 8 mg/mL以下。當(dāng)pH值大于6以后，其ACE抑制活性不斷下降。由此可知，豬股骨降血壓肽（組分2）在中性和偏酸性的條件下比較穩(wěn)定。

2.2.3 豬股骨降血壓肽的耐鹽穩(wěn)定性

圖7 不同NaCl濃度對(duì)豬股骨降血壓肽（組分2）的影響Fig.7 Effect of NaCl concentration on the activity of antihypertensive peptides from porcine femoral collagen (peak 2)

豬股骨在酶解過(guò)程中，需不斷地加入鹽酸和NaOH溶液維持pH值的恒定。由圖7可知，當(dāng)NaCl溶液濃度為0～0.6 mol/L時(shí)，豬股骨降血壓肽（組分2）的IC50值在0.401 2～0.402 9 mg/mL的范圍內(nèi)小幅波動(dòng)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析（P＞0.05），豬股骨降血壓肽（組分2）的活性變化小，差異不顯著；當(dāng)NaCl溶液濃度超過(guò)0.6 mol/L時(shí)，其IC50值開(kāi)始增大，且隨著NaCl溶液濃度的增大就會(huì)顯著降低豬股骨降血壓肽（組分2）的降血壓肽活性。

2.2.4 豬股骨降血壓肽的溶解性

圖8 豬股骨降血壓肽（組分2）的溶解性Fig.8 Solubility of ACE inhibitory peptides from porcine femoral collagen (peak 2)

從圖8可知，豬股骨降血壓肽（組分2）的溶解性在pH 7附近最低，溶解度僅為80.21%。而升高或降低pH值，其溶解度均有所提高。可能該降血壓肽的等電點(diǎn)位于pH 7附近，而導(dǎo)致其溶解度下降。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，洗脫液、流速對(duì)豬股骨降血壓肽的分離有顯著影響，其中以超純水為洗脫液的分離效果明顯較PBS好，且不引入鹽，降低成本，更有利于豬股骨降血壓肽的純化；而當(dāng)流速為0.4、0.6 mL/min時(shí)，分離效果相近，為提高分離效率采用0.6 mL/min的流速適宜。在溫度100 ℃時(shí)仍具有較高的活性，其IC50值為0.610 3 mg/mL，有良好的熱穩(wěn)定性；在pH值為2～12時(shí)，IC50值均能保持在0.47 mg/mL及以下，可耐酸堿；當(dāng)NaCl溶液濃度為0.2～1.2 mol/L時(shí)，IC50值變化不大，有較好的耐鹽穩(wěn)定性；在pH值為2～6時(shí)有良好的溶解性。

國(guó)內(nèi)外也有較多的學(xué)者研究不同蛋白源的降血壓肽[17-18]的分離純化，如Wu Jianping等[19]用SephadexG-25對(duì)大豆降壓肽進(jìn)行分離、Wu Hao等[20]利用凝膠層析分離出了IC50值達(dá)到0.4 mg/mL的高活性降血壓肽組分等。本實(shí)驗(yàn)利用凝膠層析法分離出的豬股骨降血壓肽組分，其IC50值達(dá)到0.401 6 mg/mL，較劉小紅等[9]在超濾之后的用離子交換層析分離的降血壓肽組分ACE抑制活性提高了1.2 倍。在純化降血壓肽的過(guò)程中，對(duì)降血壓肽分離純化設(shè)計(jì)尤為關(guān)鍵，不僅要保證肽的純度、回收率，更要保持肽的生物活性。因此，要選擇合適的單元操作技術(shù)或同時(shí)結(jié)合各個(gè)單元操作技術(shù)，如離子交換層析、大孔吸附樹(shù)脂、反相高效液相色譜法等進(jìn)行分離，以期達(dá)到更好分離效果，促進(jìn)降血壓肽工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] FITZ G R J, MEISEL H. Milk protein-derived peptide inhibitors of angiotensin-Ⅰ-converting enzyme[J]. British Journal of Pharmacology, 2000, 84(1): 33-37.

[2] 劉勇. 玉米蛋白ACEI活性肽的研究[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào), 2005(6): 12-16.

[3] SUROUKAT K, FIC M. Studies on the recovery of proteinaceous substances from chicken heads[J]. Journal of Food Agriculture and Environment, 1994, 65(2): 289-296.

[4] 吳瓊英, 馬海樂(lè). 發(fā)酵乳中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的分離與鑒定[J].食品科學(xué), 2006, 27(7): 81-85.

[5] 安桂香, 莊桂東, 徐振凱, 等. 食物中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2006, 27(6): 173-175.

[6] 李誠(chéng), 張小麗, 付剛. 酶解鴨骨制取ACE抑制肽工藝條件的優(yōu)化[J].中國(guó)釀造, 2011, 30(8): 61-65.

[7] 代永剛, 南喜平, 李鐵柱, 等. 酪蛋白源ACE抑制肽的分離純化[J].中國(guó)乳品工業(yè), 2010, 38(10): 21-23.

[8] MIGUEL M, CONTRERAS M M, RECIO I, et al. ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a bovine casein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2009, 61(12): 211-214.

[9] 劉小紅, 李誠(chéng), 付剛, 等. 豬股骨頭膠原蛋白降血壓肽的分離純化[J].食品科學(xué), 2014, 35(4): 50-55.

[10] 馮雅蓉, 馬儷珍, 李黎. SephadexG-25對(duì)羊骨膠原降血壓肽的分離純化效果研究[J]. 肉類(lèi)研究, 2011, 25(6): 30-33.

[11] PATRYCJA P M, LUISA M M, CONCEPCIóN G. Development of a high-performance liquid chromatography-electrospray ionization quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry methodology for the determination of three highly antihypertensive peptides in maize crops[J]. Journal of Chromatography, 2013, 87(7): 69-77.

[12] 馬歇克. 蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南[M]. 朱厚礎(chǔ), 譯. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 77.

[13] ELIZABETH E, LETICIA M, PAUL D F, et al. Purification and identification of antihypertensive peptides in Spanish dry-cured ham[J]. Journal of Proteomics, 2013, 78(6): 499-507.

[14] 鄧惠玲, 劉嘉, 陳光鏡, 等. 豬血紅蛋白ACE抑制肽的分離和理化性質(zhì)研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(10): 281-284.

[15] WANG Jiapei, HU Jianen, CUI Jinzhe, et al. Purification and identification of a ACE inhibitory peptide from oyster proteins hydrolysate and the antihypertensive effect of hydrolysatein spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chemistry, 2008, 111(18): 302-308.

[16] CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin Ⅰ-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochem Pharmacol, 1971, 20(9): 1637-1648.

[17] JIANG Zhanmei, TIAN Bo, ANDRé B. Production, analysis and in vivo evaluation of novel angiotensin-Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides from bovine casein[J]. Food Chemistry, 2010, 123(7): 779-786.

[18] CHEN Jiwang, WANG Yimei, ZHONG Qixin, et al. Purification and characterization of a novel angiotensin-Ⅰ converting enzyme (ACE) inhibitory peptide derived from enzymatic hydrolysate of grass carp protein[J]. Peptides, 2012, 33(1): 52-58.

[19] WU Jianping, DING Xiaolin. Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides[J]. Food Research International, 2002, 35(4): 367-375.

[20] WU Hao, HE Hailun, CHEN Xiulan, et al. Purification and identification of novel angiotensin-Ⅰ-converting enzymeinhibitory peptides from shark meat hydrolysate[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(4): 457-461.

Purification of Antihypertensive Peptides from Porcine Femoral Collagen by Gel Permeation Chromatography and Their Stability in vitro

SHU Yi-mei, LI Cheng*, FU Gang, CHEN Shu-juan, HE Li, YANG Yong, HU Bin, ZHANG Zhi-qing, SU Zhao
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

After the enzymatic hydrolysate of porcine femoral collagen prepared by a three-stage hydr olysis procedure sequentially with alkaline protease, papain and flavourzyme was ultrafiltrated, the fraction with molecular weight below 5 kD, showing an IC50of 1.362 mg/mL was purified by gel permeation chromatography. The effects of elution solvent, flow rate and sample loading amount on purification efficiency were examined. The best separation results were achieved by loading 1% (by volume) of the sample onto the column followed by elution with deionized water at a flow rate of 0.6 mL/min. The eluate fraction with the highest antihypertensive activity, showing an IC50of 0.401 6 mg/mL, was harvested. The stability of the antihypertensive peptides was evaluated, and the results demonstrated its good tolerance to heat, acid and alkali and high solubility at pH 2-6.

enzymatic hydrolysate of porcine femoral collagen; antihypertensive peptides; gel permeation chromatography; stability; half inhibitory concentration against ACE

TS251

A

1002-6630（2014）24-0100-05

10.7506/spkx1002-6630-201424019

2014-03-26

舒一梅（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：symsymtg@163.com

*通信作者：李誠(chéng)（1964—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。E-mail：lichenglcp@163.com