基因工程在治療周圍神經損傷中的應用

王一雄(綜述)，武忠炎(審校)

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院骨科，烏魯木齊 830011)

周圍神經損傷常導致局部感覺與運動功能障礙，而受損神經連續(xù)性的恢復是神經再生和功能恢復的決定因素。目前常用的顯微手術修復和神經移植等方法雖可恢復受損神經的連續(xù)性，但均存在著諸多弊端，神經再生及功能的恢復仍無法令人滿意[1]。神經損傷后，修復目的是為了恢復神經的連續(xù)性，為神經再生創(chuàng)造條件；而再生的成功與否取決于是否具有適合其生長的再生微環(huán)境。神經營養(yǎng)因子等物質成分是再生微環(huán)境中的重要因素，對再生神經的生長和延伸起著十分重要的營養(yǎng)和誘導作用?；蚬こ碳夹g可將神經營養(yǎng)因子基因轉染到合適的靶細胞，再移植到受損神經局部，為受損神經提供適合再生的微環(huán)境所需的神經營養(yǎng)因子，促進神經再生。因此，周圍神經損傷的基因治療有著極大的應用潛力。

1 周圍神經損傷再生

神經損傷后，損傷神經遠端發(fā)生瓦勒變性，軸突及其髓鞘裂解并被巨噬細胞吞噬，隨后施萬細胞增殖形成Bungner帶并分泌多種神經營養(yǎng)因子，加上遠端神經變性后保留的基底膜管，構成了受損神經再生微環(huán)境，最終實現(xiàn)神經再生。大量研究報道表明，神經營養(yǎng)因子在神經損傷后神經細胞的存活、軸突發(fā)芽和延伸的過程中起著十分重要的營養(yǎng)和誘導作用[2-3]。此外，還有促神經軸索生長因子和細胞外基質等物質在微環(huán)境中對神經再生起作用。由此可見，周圍神經再生有賴于神經營養(yǎng)因子的營養(yǎng)支持及細胞外基質和基底膜管構成的微環(huán)境。

2 周圍神經損傷的基因治療

基因治療是將有特定功能的基因導入靶細胞并植入受損神經局部，使其表達并發(fā)揮生物學效應，達到治療目的?；蛑委煹年P鍵是目的基因的選擇、載體工具的選擇及靶細胞的選擇。

2.1神經營養(yǎng)因子和目的基因的選擇 神經營養(yǎng)因子是由靶組織合成的一組可經軸漿逆行轉運至神經元胞體,并對其提供營養(yǎng)支持以及維持其存活的多肽類物質。其作用機制為：通過與靶細胞表面特定種類的酪氨酸激酶受體結合，激活受體并通過細胞內信號轉導產生蛋白磷酸化作用，最后激活基因。神經損傷后軸突的連續(xù)性中斷，神經營養(yǎng)因子無法逆行轉運至神經元胞體發(fā)揮作用，此時外源加入神經營養(yǎng)因子可誘導再生的軸突沿神經營養(yǎng)因子的濃度梯度生長并維持神經元存活。神經營養(yǎng)因子主要包括神經生長因子、腦源性神經營養(yǎng)因子、堿性成纖維細胞生長因子、睫狀神經節(jié)營養(yǎng)因子、神經營養(yǎng)素3、4/5、6、7等。此外，還有其他的神經營養(yǎng)因子，如白細胞抑制因子、類胰島素生長因子、表皮生長因子、膠質源性神經營養(yǎng)因子、血小板源性生長因子、轉化生長因子β等。黃昭瑄等[4]用神經生長因子治療糖尿病周圍神經病變，發(fā)現(xiàn)神經生長因子是治療糖尿病周圍神經病變的一種安全、有效的藥物。鄭明輝等[5]通過實驗證實，腦源性神經營養(yǎng)因子基因修飾骨髓間充質干細胞對周圍神經損傷后神經纖維的再通及功能恢復有促進作用。王曉亮等[6]通過動物實驗證實,應用堿性成纖維細胞生長因子-殼聚糖導管能有效修復周圍神經損傷并使大鼠運動功能得到改善。周洪偉等[7]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，睫狀神經節(jié)營養(yǎng)因子能顯著促進大鼠視神經節(jié)細胞突起再生，且高濃度的睫狀神經節(jié)營養(yǎng)因子能較早促進突起再生。

近年來許多神經營養(yǎng)因子基因得到克隆，通過基因轉染技術，將神經營養(yǎng)因子基因轉染到合適的受體細胞，再移植到損傷局部，使其向損傷局部提供神經營養(yǎng)因子，為損傷神經提供適合再生的微環(huán)境，促進損傷神經再生。Sorensen等[8]經實驗證實,可通過腺病毒將神經營養(yǎng)因子的基因轉移至受損神經的施萬細胞，使其有效表達來促進損傷神經的修復。Gravel等[9]將攜帶腦源性神經營養(yǎng)因子和睫狀神經節(jié)營養(yǎng)因子基因的重組腺病毒載體直接轉入大鼠損傷神經的施萬細胞，使其有效表達，促進了神經軸突的再生。此外，還有許多研究和報道表明，Ad-32Ep65-Flag基因、Bex-1(brain-expressed X-linked) 基因、Wld(S) (Wallerian degeneration slow) 變異基因、miR-1和miR-206基因、PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因等均可在周圍神經損傷的修復治療中發(fā)揮作用，促進損傷神經的再生[10-15]。

2.2基因治療途徑與載體工具 基因治療有兩種基本途徑：①體內直接基因治療或稱一步法(invivo)：指將含外源基因的重組病毒、脂質體或裸露的DNA直接導入體內。一步法的優(yōu)點是無需中介細胞的參與、操作簡便、實用性強、更接近于臨床；弊端是該法尚不成熟，存在療效短、免疫排斥及安全性等問題。但一步法是基因轉載治療的研究方向，該法成熟與否決定了基因治療能否真正走上臨床；②體內間接基因治療或稱二步法(exvivo)：指將外源基因克隆至一個合適的載體，首先導入體外培養(yǎng)的有特定條件的細胞，經篩選后將能表達外源基因的受體細胞重新輸回受試者體內。該法較經典、安全，而且易控制效果，但步驟繁瑣、技術難度大、不易推廣。

基因載體需含有可供目的基因表達的特定調控序列，包括病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體轉移效率高，但存在一些問題，如病毒產物的免疫原性、基因轉移靶向性以及基因表達的時間和水平等。目前常用的病毒載體有腺病毒載體、單純皰疹病毒相關載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體。Hayashi等[16]研究了由腺病毒攜帶的人肝細胞生長因子對成年大鼠周圍神經撕脫損傷的作用，發(fā)現(xiàn)腺病毒可作為周圍神經損傷基因治療的有效載體。Dhar等[17]通過研究證實了單純皰疹病毒作為基因載體在組織工程學有廣闊的前景。反轉錄病毒由于其較高的致突變性以及不能感染非分裂細胞,因此將它用于治療神經元損傷可能性較小。但通過導入自殺基因或編碼毒性因子的基因來治療腦腫瘤等神經系統(tǒng)疾病有較大的潛力，所以反轉錄病毒作為載體治療神經損傷有一定的前景，尚需深入研究。腺相關病毒是一種缺陷病毒，它可以靶向整合，能感染分裂和靜止細胞，現(xiàn)被認為是神經系統(tǒng)基因治療中最有前途的高效載體。但因其裝載外源基因的容量有限，目前主要應用于中樞神經損傷的治療。非病毒轉運載體轉導的外源基因不整合入宿主細胞的基因，不改變宿主細胞的基因組，但外源基因有效表達時間較短。目前主要應用裸DNA注射法、電穿孔法、磷酸鈣沉淀、顯微注射法、脂質體法等。

2.3靶細胞的選擇 基因工程所需的靶細胞是指能攝取外源基因并保持其穩(wěn)定表達的細胞，要求有良好的分裂增殖能力、良好的促外源基因表達能力和良好的生物安全性。主要有施萬細胞、骨髓間充質干細胞、神經干細胞和胚胎干細胞等。目前研究最多的是施萬細胞和骨髓間充質干細胞。

2.3.1施萬細胞 施萬細胞在周圍神經損傷、再生與修復中起著關鍵作用，其作用主要有：①增殖形成Bungner帶，為再生軸突生長提供通道[18]；②分泌多種神經營養(yǎng)因子，維持神經元存活，促進再生軸突生長；③分泌與神經再生有關的細胞外基質成分以及可引導軸突再生的黏附因子，為再生軸突提供良好的再生微環(huán)境，促進神經再生；④包繞再生軸突，形成無髓及有髓纖維、促進再生軸突的成熟；⑤與再生軸突形成縫隙連接和緊密連接，直接與再生軸突進行物質交換。Hadlock等[19]用填充施萬細胞的聚合物植入神經缺損處，發(fā)現(xiàn)可以顯著促進神經纖維的再生。但有研究發(fā)現(xiàn)，施萬細胞缺乏持續(xù)分泌再生軸突穩(wěn)定生長所需的神經營養(yǎng)因子和細胞外基質等物質的能力[20-21]。增強施萬細胞分泌效應的持續(xù)性成為影響神經再生的關鍵。于志勇等[22]通過實驗發(fā)現(xiàn)，導入神經生長因子基因的施萬細胞可在體內長期存活并形成新的髓鞘，促進軸突生長和損傷神經的再生，為慢性神經損傷的基因治療提供了新的方法。施新革等[23]提出轉染神經生長因子3基因的施萬細胞移植于損傷的周圍神經，有促進神經生長、髓鞘再生的作用，能彌補單純細胞移植、神經營養(yǎng)因子含量的不足。因此，施萬細胞可作為良好的基因受體靶細胞應用于基因治療周圍神經損傷。

2.3.2骨髓間充質干細胞 骨髓間充質干細胞是存在于骨髓中除造血干細胞外的另一種干細胞，來源豐富、有多向分化潛能、自我復制能力強、易于在體外獲得和擴增、免疫原性低，且其獨特的細胞增殖模式使外源基因易于導入并表達。大量研究表明，骨髓間充質干細胞可以在體外及體內誘導分化為神經組織的細胞，并能分泌多種利于神經再生的神經營養(yǎng)因子，促進軸突的再生和髓鞘形成[24-25]。Nie等[26]將骨髓間充質干細胞與膠原混合后放入聚乳酸聚羥基乙酸共聚體管中，橋接大鼠坐骨神經缺損，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞可促進神經再生。黃世勇等[27]通過實驗證實，導入神經生長因子基因的大鼠骨髓間充質干細胞可在大鼠體內存活并穩(wěn)定表達。所以，骨髓間充質干細胞可較好地作為基因工程的靶細胞應用于周圍神經損傷的治療。

3 結 語

基因工程技術在周圍神經損傷治療的領域有廣闊的應用前景，但許多研究尚處于基礎研究和動物實驗階段，存在許多的不足，沒有廣泛應用于臨床治療的條件，還存在一些問題亟待解決，如目的基因的高效持續(xù)表達的問題、基因轉染途徑的實用性問題、載體工具的安全性問題、靶細胞選擇的理想性問題以及基因轉移中的不良反應問題等。相信隨著相關研究的不斷深入，基因工程技術會最終成為周圍神經損傷的臨床治療的重要手段。

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