特異性溶瘤腺病毒治療膀胱癌的研究進(jìn)展

李永前(綜述)，王志平(審校)

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科研究所 甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，蘭州 73000)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在全世界男性惡性腫瘤排行中居第六位[1]。在我國膀胱癌的發(fā)病率一直高居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤首位，且其發(fā)病率還在逐年上升，其中90%～95%為移行上皮細(xì)胞癌。目前治療膀胱癌的效果都不令人滿意。研究顯示，表淺性膀胱癌經(jīng)過手術(shù)化療后復(fù)發(fā)率為20%～30%，10%～20%的患者進(jìn)展為浸潤性膀胱癌[2]。而浸潤性膀胱癌的預(yù)后不佳，其5年生存率僅為50%[3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們通過構(gòu)建選擇復(fù)制性溶瘤腺病毒載體治療膀胱癌讓人們看到了希望，在這項(xiàng)技術(shù)中組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控溶瘤腺病毒治療膀胱癌成為了研究熱點(diǎn)。

1 特異性啟動(dòng)子調(diào)控溶瘤腺病毒治療膀胱癌的原理

溶瘤腺病毒又稱為條件復(fù)制性腺病毒，是由腺病毒進(jìn)行基因改造后得。溶瘤腺病毒感染腫瘤細(xì)胞后，首先突破腫瘤細(xì)胞的防御系統(tǒng)，進(jìn)入細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡破碎，使其內(nèi)的病毒釋放出來，繼續(xù)作用于周圍的腫瘤細(xì)胞，以此循環(huán)，直到腫瘤細(xì)胞被全部裂解，因?yàn)槿芰鱿俨《咀陨砣毕葜荒茉谀[瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制，而不能夠在正常細(xì)胞中復(fù)制，因此腫瘤細(xì)胞裂解完全后溶瘤腺病毒不能夠再次復(fù)制，隨后被免疫系統(tǒng)清除。由于溶瘤腺病毒具有條件復(fù)制性的特點(diǎn)使其能夠特異性溶解和殺傷瘤細(xì)胞，而不損傷正常組織[4]。在這基礎(chǔ)上加上特異性啟動(dòng)子，溶瘤腺病毒具有更好的靶向性，并且增加了溶瘤腺病毒的溶瘤作用。

1.1腺病毒 腺病毒是直徑為70.90 nm的二十面體的無包膜雙鏈DNA病毒，能通過直徑為400～600 nm的腫瘤血管漏孔到達(dá)腫瘤細(xì)胞，其因具有嗜上皮細(xì)胞性(膀胱癌90%～95%是移行上皮性)、對(duì)人低毒性(安全，不良反應(yīng)小)、不整合到宿主染色體(無致癌和致突變的風(fēng)險(xiǎn))、病毒基因組發(fā)生重排較少(病毒基因穩(wěn)定，不會(huì)發(fā)生致命性突變)、同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因(能夠插入幾個(gè)基因使其同時(shí)表達(dá)，發(fā)揮協(xié)同作用)、容易制備高滴度病毒等優(yōu)點(diǎn)，成為了在基因治療中應(yīng)用最廣泛的載體之一[5]。

1.2溶瘤腺病毒的構(gòu)建策略 目前認(rèn)為腺病毒復(fù)制的必要條件是其感染的細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在腺病毒感染細(xì)胞后E1A最早被轉(zhuǎn)錄，它編碼的E1A蛋白與E2F-Rb復(fù)合體中的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白結(jié)合，導(dǎo)致E2F-Rb復(fù)合體分離，E2F釋放后促使細(xì)胞由G1進(jìn)入S期，與此同時(shí)細(xì)胞的自我防御機(jī)制也被激活，p53的降解受到抑制，隨著p53降解減少，p53在細(xì)胞內(nèi)積聚，并與p53反應(yīng)子結(jié)合激活細(xì)胞周期停滯基因和凋亡誘導(dǎo)基因，從而阻止細(xì)胞進(jìn)入S期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是病毒早期蛋白質(zhì)E1B與細(xì)胞內(nèi)p53結(jié)合使之失活，使宿主細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，保證了病毒復(fù)制周期的順利進(jìn)行[6]。由此可以看出，E1A和E1B是腺病毒在正常細(xì)胞中必不可少的條件，而在此基礎(chǔ)上科研工作者通過改變或調(diào)控E1A和(或)E1B基因來構(gòu)建相應(yīng)的溶瘤腺病毒。目前構(gòu)建溶瘤腺病毒的策略主要有3個(gè)：①剔除腫瘤細(xì)胞復(fù)制不需要但是正常細(xì)胞需要的基因，如p53腺病毒[5]；②用腫瘤組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒增殖所必須的基團(tuán)；③改變腺病毒外殼的纖毛蛋白，達(dá)到特異感染腫瘤細(xì)胞的目的[7]。

1.3治療膀胱癌的溶瘤腺病毒的特異性啟動(dòng)子 溶瘤腺病毒治療膀胱癌時(shí)，病毒攜帶的目的基因不可避免地在膀胱癌外多種組織表達(dá)，殺傷膀胱癌組織之外的正常組織，因此如何解決溶瘤腺病毒的靶向性問題成為其中的關(guān)鍵點(diǎn)，組織特異性啟動(dòng)子解決了此類問題，它們僅在靶組織細(xì)胞中具有活性，從而使溶瘤腺病毒特異性地在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)，在其他組織中不表達(dá)，避免了對(duì)其他組織的不良反應(yīng)。目前在研究的啟動(dòng)子主要有3類：①調(diào)控腺病毒中的E1A基因的啟動(dòng)子，如人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcript-tase,hTERT)啟動(dòng)子、環(huán)加氧酶2(cyclo-oxygenase 2,COX-2)啟動(dòng)子、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)啟動(dòng)子、肝素結(jié)合細(xì)胞因子(midkine,MK)啟動(dòng)子、人UroplakinⅡ(human uroplakinⅡ,hUPⅡ)啟動(dòng)子；②調(diào)控腺病毒中E1B基因的啟動(dòng)子，如缺氧啟動(dòng)子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)；③其他，如UPⅡ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、ORE(Oct-3/4 response element)結(jié)合CMVmini啟動(dòng)子、Survivin驅(qū)動(dòng)抑癌基因LRIG1啟動(dòng)子。

2 特異性啟動(dòng)子調(diào)控溶瘤腺病毒治療膀胱癌

2.1特異性啟動(dòng)子調(diào)控E1A基因的腺病毒治療膀胱癌 COX-2是一種前列腺素合成酶，高表達(dá)于多種癌前病變以及惡性腫瘤中，包括膀胱癌。Shirakawa等[8]在2004年以此構(gòu)建了腺病毒AdE3-COX2-327，該病毒由COX-2作為啟動(dòng)子控制E1A，體外試驗(yàn)顯示AdE3-COX2-327能夠在COX-2和腺病毒受體(coxsackievims-adenovims receptor，CAR)的雙表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞5637、A549和KK47中復(fù)制并且表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用，而在表達(dá)COX-2、不表達(dá)CAR的T-24以及只表達(dá)CAR而不表達(dá)COX-2的H358、Colo320中不復(fù)制、也無細(xì)胞毒性作用，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)AdE3-COX2-327能夠抑制腫瘤細(xì)胞KK47的生長。

2006年，Melquist等[9]構(gòu)建了由BSP作為啟動(dòng)子控制E1A基因的溶瘤腺病毒Ad-BSP-E1A,對(duì)其進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)Ad-BSP-E1A對(duì)BSP和CAR陽性的膀胱癌細(xì)胞敏感，感染腫瘤細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞具有殺傷作用。MK在包括膀胱癌在內(nèi)的幾種腫瘤細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)，但是在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。Terao等[10]在2007年根據(jù)其特性構(gòu)建了MK啟動(dòng)子控制E1A基因的溶瘤腺病毒Ad-MK-E1A，該研究發(fā)現(xiàn)Ad-MK-E1A在5637、KK47和A549三種MK高表達(dá)的細(xì)胞中比在H891和T24這兩種MK低表達(dá)的細(xì)胞T24、H891中的復(fù)制能力更強(qiáng)；Ad-MK-E1A不能抑制H891的生長，但能抑制T-24、A549、KK47、5637腫瘤細(xì)胞的生長，抑制作用隨著細(xì)胞表達(dá)MK信使RNA的增多逐漸增強(qiáng)。在動(dòng)物模型體內(nèi)，Ad-MK-E1A注入明顯抑制腫瘤生長KK47。

在尿路上皮細(xì)胞中存在的糖Uroplakins蛋白是整合薄膜蛋白組中的一種，僅表達(dá)于尿路上皮，在其他組織幾乎不表達(dá)，UPⅡ是其中一種，具有膀胱特異性，在膀胱移行上皮細(xì)胞癌中幾乎100%表達(dá)。He等[11]構(gòu)建了UPⅡ啟動(dòng)子控制E1A的腺病毒Ad-UPⅡ-E1A，在將重組腺病毒Ad-UPⅡ-E1A感染膀胱癌細(xì)胞BIU-87后應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞中EIA蛋白為陽性，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]實(shí)驗(yàn)表明，重組腺病毒Ad-UPⅡ-E1A明顯抑制膀胱癌細(xì)胞BIU-87的生長。田俊強(qiáng)等[12]隨后研究了一氧化氮(nitric oxide,NO)對(duì)Ad-UPⅡ-E1A轉(zhuǎn)染膀胱癌腫瘤的影響，結(jié)果顯示，NO能夠促進(jìn)溶瘤腺病毒Ad-UPⅡ-E1A轉(zhuǎn)染膀胱腫瘤細(xì)胞的效率,但不同濃度NO對(duì)溶瘤腺病毒的溶瘤效果具有雙向調(diào)節(jié)作用,其中低劑量的NO能夠下調(diào)重組病毒E1A的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,高劑量的NO通過上調(diào)E1A的表達(dá)發(fā)揮溶瘤效應(yīng)。

UPⅡ能表達(dá)于正常的膀胱上皮細(xì)胞，且復(fù)制能力較低。由此Wang等[13]在Ad-UPⅡ-E1A的UPⅡ啟動(dòng)子前面加上前列腺干細(xì)胞抗原增強(qiáng)子(prostate stem cell antigen enhancer，PSCAE)構(gòu)建了腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A，隨后轉(zhuǎn)染不同組織來源細(xì)胞系并且與改造前進(jìn)行對(duì)比，雄激素依賴實(shí)驗(yàn)和裂解細(xì)胞T-24實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UPⅡ啟動(dòng)子具有組織特異性，它能夠使其后的目的基因僅能夠高表達(dá)于膀胱癌中，PSCAE能夠增強(qiáng)UPⅡ啟動(dòng)子的活性；膀胱癌雄激素受體激動(dòng)劑僅在雄激素受體(androgen receptor,AR)陽性膀胱癌細(xì)胞中提高腺病毒活性，而雄激素受體阻斷劑只能夠阻斷部分PSCAE活性；溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A可以有效裂解膀胱癌細(xì)胞T-24。AR的表達(dá)抑制E1A的表達(dá)，但是將AR和E1A融合構(gòu)成E1A-AR并處于同一雄激素依賴性啟動(dòng)子下游后可以提高雄激素依賴性啟動(dòng)子的活性，增強(qiáng)溶瘤腺病毒的復(fù)制。Zhai等[14]構(gòu)建了溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR，體外研究顯示，病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞(如EJ、5637、BIU87)有較的強(qiáng)殺傷作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能顯著抑制裸鼠皮下膀胱癌移植瘤生長，延長荷瘤鼠的壽命。同時(shí)，Wang等[15]對(duì)溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A及Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR在小鼠體內(nèi)進(jìn)行安全性檢測，結(jié)果顯示，注射病毒的小鼠體質(zhì)量、健康狀況及行為都未發(fā)現(xiàn)異常，血液學(xué)中淋巴細(xì)胞百分比、血小板數(shù)量無明顯改變，注射病毒后的小鼠體內(nèi)重要臟器(如心、腦等)未出現(xiàn)異常，腺病毒僅在膀胱移植瘤組織內(nèi)復(fù)制和表達(dá)，證實(shí)腺病毒的近期安全性。

2.2特異性啟動(dòng)子調(diào)控E1B基因的腺病毒治療膀胱癌 膀胱癌細(xì)胞中hTERT轉(zhuǎn)錄水平升高，致使細(xì)胞端粒酶活性明顯增強(qiáng)。HIF-1在膀胱腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)[16]。胡建鵬等[17]構(gòu)建了由hTERT啟動(dòng)子控制E1A基因，HIF-1啟動(dòng)子控制E1B基因的雙調(diào)控?cái)y帶超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素A (staphylococcus enterotoxin A,SEA)基因的腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒SG502-SEA，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)攜帶SEA基因的hTERT/HIF雙調(diào)控溶瘤腺病毒可在鼠膀胱癌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、增殖并表達(dá)SEA基因，且其對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯殺傷作用。

2.3其他類型腺病毒治療膀胱癌 朱宏建等[18]將hUPⅡ啟動(dòng)子和TNF-α克隆到腺病毒Ad5中，構(gòu)建重組體pAd-UPⅡ-TNF，研究表明BIU-87細(xì)胞經(jīng)重組腺病毒感染后可產(chǎn)生高水平的TNF-α,并降低BIU-87的生長速度，感染腺病毒的BIU-87培養(yǎng)液可抑制L929細(xì)胞的生長。裸鼠實(shí)驗(yàn)顯示，膀胱灌注重組腺病毒48 h后,裸鼠尿液含高水平的TNF-α,4周后腺病毒組膀胱質(zhì)量和體積顯著低于對(duì)照組。Oct-3/4參與腫瘤的生長，在膀胱癌中大量表達(dá)，在正常細(xì)胞中檢測不到。由此，Wu等[19]構(gòu)建了E1B缺失腺病毒Ad.90C，該病毒由Oct-3/4反應(yīng)元件和CMVmini啟動(dòng)子共同控制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Oct-3/4表達(dá)水平越高的細(xì)胞中Ad.9OC顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞溶解效應(yīng)，特別是Oct-3/4陽性的轉(zhuǎn)移性膀胱癌，而在正常的細(xì)胞中無不良反應(yīng)。Survivin基因的表達(dá)產(chǎn)物Survivin蛋白具有抗凋亡作用，其在多種腫瘤中大量表達(dá)，包括膀胱癌，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)。嚴(yán)澤軍等[20]由此構(gòu)建了腺病毒Ad-Surp-LRIG1，該病毒是將抑癌基因LRIG1導(dǎo)入腺病毒后在其前面加上Survivin啟動(dòng)子控制其增殖，隨后對(duì)其進(jìn)行純化，鑒定并測定其滴度，結(jié)果顯示成功構(gòu)建了溶瘤腺病毒Ad-Surp-LRIG1，其可用于進(jìn)一步研究。隨后蔣軍輝等[21]用該病毒對(duì)T24(人膀胱癌細(xì)胞株)進(jìn)行轉(zhuǎn)染確定其增殖能力以及是否能影響T24細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，其在T24中能夠增殖并且可使T24細(xì)胞的侵襲能力得到抑制。

3 結(jié)語和展望

自2003年以來，特異性啟動(dòng)子溶瘤腺病毒治療膀胱癌取得了巨大的進(jìn)步，在新病毒的探索等方面取得了巨大的成就，但是仍有些問題需要解決。①免疫問題：機(jī)體對(duì)溶瘤腺病毒的免疫清除作用影響著溶瘤腺病毒在機(jī)體內(nèi)的作用，特別是治療膀胱癌的轉(zhuǎn)移病灶時(shí)該問題更加明顯。②目前的研究都只是在體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及鼠模型上進(jìn)行，其臨床效果還不得而知。③特異性啟動(dòng)子溶瘤腺病毒的感染能力較低，有待進(jìn)一步提高，其與傳統(tǒng)放、化療的相互作用有待研究。④溶瘤腺病毒的安全性還有待研究，特別是長遠(yuǎn)影響，目前這方面還缺乏研究。隨著科學(xué)的進(jìn)步，對(duì)膀胱癌和溶瘤腺病毒的研究將更加深入，以上問題也將逐漸得到解決，特異性啟動(dòng)子調(diào)控的溶瘤腺病毒必將成為人類攻克膀胱癌的利器。

[1] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[2] Herr HW,Wartinger DD,Fair WR,etal.Bacillus Calmette-Guerin therapy for superficial bladder cancer:a 10 year followup[J].J Urol,1992,147(4):1020-1023.

[3] Voutsinas GE,Stravopodis DJ.Molecular targeting and gene delivery in bladder cancer therapy[J].J BUON,2009,14(Suppl 1):S69-S78.

[4] Kanerva A,Hemminki A.Adenoviruses for treatment of cancer[J].Ann Med,2005,37(1)：33-43.

[5] Wildner O,Morris JC.The role of the EIB 55 kDa gene product in oncolytic adenoviral vectors expressing herpes simplex Virus-tk:assessment of antitumor efficacy and toxicity[J].Cancer Rcs,2000,60(15):4167-4174.

[6] Ries S，Korn WM.ONYX-015:mechanism of action and clinical potential of a replication—selective adenovirus[J].Br J Cancer,2002,86(1):5-11.

[7] Kohno S,Luo C,Goshima F,etal.Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer[J].Urology,2005,66(5):1116-1121.

[8] Shirakawa T,Hamada K,Zhang Z,etal.A COX-2 promoter based replication selective adenoviral vector to target the COX-2 expressing human bladder cancer cells[J].Clin Cancer Res,2004,10(13):4342-4348.

[9] Melquist JJ,Kacka M,Malaeb BS,etal.Conditionally replicating adenovirus-mediated gene therapy in bladder cancer:an orthotopic in vivo model[J].Urol Oncol,2006,24(4):362-371.

[10] Terao S,Shirakawa T,Kubo S,etal.Midkine promoter-based conditionally replicative adenovirus for targeting midkine expressing human bladder cancer model[J].Urology,2007,70(5):1009-1013.

[11] He XD,Wang ZP,Wang DG,etal.Construction of urothelium specific recombinant adenovirus and its inhibition in bladder cancer cell[J].Urol Int,2009,82(2):209-213.

[12] 田俊強(qiáng),李仁舉,王志平,等.一氧化氮對(duì)組織特異性溶瘤腺病毒轉(zhuǎn)染膀胱腫瘤細(xì)胞的影響[J].臨床泌尿外科雜志，2012,27(2):150-153.

[13] Wang D,Wang Z,Tian J,etal.Prostate stem cell antigen enhancer and uroplakin Ⅱ promoter based bladder cancer targeted tissue specific vector[J].Urol Oncol,2010,28(2):164-169.

[14] Zhai Z,Wang Z,Fu S,etal.Antitumor effects of bladder cancer-specific adenovirus carrying E1A-androgen receptor in bladder cancer[J].Gene Ther,2012,19(11):1065-1074.

[15] Wang F,Wang Z,Tian H,etal.Biodistribution and safety assessment of bladder cancer specific recombinant oncolytic adenovirus in subcutaneous xenografts tumor model in nude mice[J].Curr Gene Ther,2012,12(2):67-76.

[16] 李懷富,韓從輝,董秉政,等.缺氧啟動(dòng)子-1α在膀胱癌中的表達(dá)及其意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2009,26(3):361-362．

[17] 胡建鵬,郝林,張培影,等.雙調(diào)控溶瘤腺病毒介導(dǎo)超抗原SEA基因靶向膀胱腫瘤表達(dá)[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2010,27(8):1131-1133.

[18] 朱宏建,魏守順,郭應(yīng)祿,等.人UroplakinⅡ啟動(dòng)子用于靶向性基因治療膀胱癌的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華泌尿外科雜志,2006,27(增刊):18-21.

[19] Wu CL,Shieh GS,Chang CC,etal.Tumor selective replication of an oncolytic adenovirus carrying Oct-3/4 response elements in murine metastatic bladder cancer model[J].Clin Cancer Res,2008,14(4):1228-1238.

[20] 嚴(yán)澤軍,程躍,蔣軍輝,等.Survivin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LRIG1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定[J].現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,24(2):133-136.

[21] 蔣軍輝,嚴(yán)澤軍,程躍,等.Survivin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)LRIG1基因表達(dá)的重組腺病毒對(duì)人膀胱癌細(xì)胞T24侵襲能力的影響[J].現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志,2013,5(3):162-166.