FH基因在遺傳性平滑肌瘤病及腎癌綜合征中的研究進(jìn)展

周婷婷(綜述)，邢金春(審校)

(福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350004)

遺傳性平滑肌瘤及腎細(xì)胞癌(hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer，HLRCC)綜合征是一種不同于普通家族性的腎癌[如Von Hippel-Lindau綜合征(VHL)、遺傳性乳頭狀腎癌]，是孤立及單側(cè)出現(xiàn)在腎臟的腎腫瘤，并普遍發(fā)生皮膚及子宮平滑肌瘤，其腎腫瘤比其他類型的家族性腎癌更具侵襲性[1]。HLRCC臨床表現(xiàn)的基因外顯率低于皮膚及子宮的病變，僅有少一部分進(jìn)展為腎癌[2]。該文就延胡索酸水化酶(fumarate hydratase，F(xiàn)H)基因在HLRCC綜合中的研究。

1 HLRCC的發(fā)病機(jī)制

1.1延胡索酸水化酶基因 HLRCC基因位點(diǎn)定位于染色體1q42.3～q43，即為目前大量證實(shí)的FH基因，其被定義為腫瘤抑制基因，大小約22 kb，含10個(gè)外顯子，在物種間呈高度保守，1q32和1q42～43雜合性缺失突變[3]。FH基因產(chǎn)物為FH(反丁烯二酸酶)，亦稱延胡索酸水化酶(fumarate hydra-tase)，是催化延胡索酸+H2O→L-蘋果酸可逆進(jìn)行相互轉(zhuǎn)變反應(yīng)的關(guān)鍵酶。FH基因失活突變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)延胡索酸水平異常升高。有研究證明，延胡索酸可結(jié)合并抑制EGLN(egg-laying nine，F(xiàn)e2+和酮戊二酸依賴的雙加氧超家族基因)/脯氨酸羥化酶(prolyl hydroylase，PHD)活性[4]。FH基因在生殖細(xì)胞的兩個(gè)等位基因的突變會(huì)造成一種隱性遺傳病，由于突變使機(jī)體所有組織中此酶缺少或活性下降，導(dǎo)致延胡索酸尿以及神經(jīng)損害、肌張力減退、癲癇、面部和大腦先天性畸形等臨床表現(xiàn)；然而雜合子的雙親是神經(jīng)系統(tǒng)無癥狀的基因突變的攜帶者。突變使酶活性降低，其腫瘤易患因素與HLRCC相似[5]。

1.2低氧誘導(dǎo)因子——低氧環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄活化因子 低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)歸屬于PAS(Per-ARNT-Sim)家族，是以螺旋-環(huán)-螺旋為基礎(chǔ)的異構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，由對氧敏感的α亞單位和結(jié)構(gòu)表達(dá)型β單位構(gòu)成，隨細(xì)胞氧水平變化應(yīng)答。HIF至今發(fā)現(xiàn)3個(gè)同源型家族成員，即HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α。HIF-1α基因位于染色體14q21～q24，β亞單位基因位于染色體1q21。HIF-1α在所有組織中均有表達(dá)，HIF-2α的表達(dá)受限且僅在某些組織(如肝細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)中表達(dá)。在正常氧條件下，HIF在大多數(shù)細(xì)胞低水平表達(dá)。低氧環(huán)境下，HIF-α與HIF-β異源二聚化形成功能轉(zhuǎn)錄因子(其主要受HIF-α亞基的數(shù)量變化調(diào)節(jié)及激活)，HIF的表達(dá)顯著增加，其復(fù)合物在缺血反應(yīng)基因的增強(qiáng)區(qū)域與保守的低氧反應(yīng)元件(5′-RCGTG-3′)相結(jié)合，將導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)移，代謝轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管生成靶基因的表達(dá)變化等多種效應(yīng)，特別是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。HIF-α在正常氧含量細(xì)胞中迅速被氧敏感的PHD(3種)降解，異源二聚化水平減少。

1.3HIF-1α和HIF-2α氧依賴調(diào)節(jié)機(jī)制 HIF-1α亞基依賴于在細(xì)胞內(nèi)的有氧狀態(tài)下通過HIF-α的氧依賴轉(zhuǎn)錄修飾。HIF-1α亞基在分子中間部分有兩個(gè)獨(dú)立的亞區(qū)域，被命名為氧依賴降解區(qū)(ODD),分別為N端-ODD和C端-ODD，這兩個(gè)區(qū)域重疊兩個(gè)激活區(qū)(NAD和CAD),在含氧量正常時(shí)表現(xiàn)去穩(wěn)定性[6]。在氧含量正常的狀態(tài)下，鐵依賴性脯氨酸?；噶u化位于N端-ODD,C端-ODD中的兩個(gè)關(guān)鍵的脯氨酸殘基(HIF-1α的pro403，pro564和HIF-2α的pro531，pro405)。顯性的PHDs定位于HIF脯氨酰羥化酶基因，即Egl-9。另外，HIF-1α亞基的天冬酰胺基位(HIF-1α的Asn803和HIF-2α的Asn855)在氧含量正常條件下還受HIF-1抑制因子酶羥化。因此，HIF的調(diào)節(jié)依賴兩種氧依賴型調(diào)節(jié)機(jī)制。在低氧情況下，INF-α蛋白酶水解抑制，Asn羥化基被釋放出CAD域允許轉(zhuǎn)錄單元活化。

1.4FH基因突變細(xì)胞或HLRCC腫瘤細(xì)胞株中“假缺氧”驅(qū)動(dòng)機(jī)制 HLRCC的發(fā)病機(jī)制可能存在抗凋亡，氧化應(yīng)激及“假缺氧”驅(qū)動(dòng)機(jī)制，而“假缺氧”驅(qū)動(dòng)發(fā)揮著重要作用，其在正常氧分壓下細(xì)胞缺氧反應(yīng)異常激活，而此途徑存在不依賴低氧環(huán)境的HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)。在氧分壓正常條件下，HIF-1α的脯氨酸羥化作用允許VHL的識(shí)別及其介導(dǎo)的HIF-α降解。FH功能喪失時(shí)三羧酸循環(huán)受阻，延胡索酸積聚，糖酵解加強(qiáng)，激活PHD酶(鐵依賴性脯氨酸?；?抑制劑的活性，而抑制Von Hippel-Lindau腫瘤抑制蛋白(Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein，pVHL)介導(dǎo)的HIF-α降解，HIF-α上調(diào)(HIF-β上調(diào)程度較輕)，HIF-α僅與HIF-β異二聚體化，引起級聯(lián)效應(yīng)，微血管密度增加，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，從而有利于腫瘤發(fā)生。Yang等[7]利用UOK262細(xì)胞株證實(shí)氧化磷酸化受阻和加速糖酵解，是HLRCC三羧酸循環(huán)酶缺乏發(fā)生的必要環(huán)節(jié)。FH基因剔除小鼠的研究為在HLRCC腫瘤細(xì)胞株不依賴低氧環(huán)境HIF的穩(wěn)定表達(dá)提供了有力支持，在其進(jìn)展性腎囊腫中是以 HIF-1α表達(dá)升高和HIF激活下游Glut1(葡萄糖載體1)及VEGF基因轉(zhuǎn)錄增加為特點(diǎn)[8-9]。Sudarshan等[10]在FH失活的HLRCC細(xì)胞株UOK262檢測到部分由NADPH氧化酶和蛋白激酶8介導(dǎo)的葡萄糖依賴的活性氧類增加，繼而由活性氧類介導(dǎo)的HIF-1α穩(wěn)定性增加，該研究解釋了HLRCC腫瘤細(xì)胞高表達(dá)HIF-1α及激活缺氧途徑基因的重要性。

1.5HIF-α可能在所有類型腎癌中穩(wěn)定表達(dá) VHL是遺傳性腎癌最常見的類型，其主要機(jī)制是VHL基因突變，HIF-1α也在VHL突變的腎癌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。pVHL是哺乳動(dòng)物E3泛素化連接酶復(fù)合物的底物識(shí)別組件，識(shí)別羥基化的HIF-α保守的脯氨酰殘基由PHD催化發(fā)生羥基化，pVHL與elongin C、elongin B、Cul2、Rbx-1等蛋白結(jié)合形成一個(gè)多蛋白復(fù)合物聚泛素化HIF-α，繼而26S蛋白酶降解HIF-α。VHL基因突變致pVHL功能失調(diào)，HIF-α不能被降解，HIF-α聚集，激活下游參與短期或長期適應(yīng)缺氧的基因轉(zhuǎn)錄，這些基因主要有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1、碳酸酐酶Ⅸ、VEGF、紅細(xì)胞生成素、轉(zhuǎn)化生長因子α，血小板衍生因子β等。更有趣的是，HIF的上調(diào)可能在所有類型的腎癌中起核心作用。結(jié)節(jié)硬化癥的基因1/2任何一個(gè)功能喪失都會(huì)破壞這兩個(gè)蛋白的復(fù)合體和釋放哺乳動(dòng)物西羅莫司靶蛋白抑制劑，促使HIF-α合成表達(dá)，導(dǎo)致透明細(xì)胞型腎癌的發(fā)生。Kim等[11]進(jìn)一步在不同類型的家族性腎癌患者的腎皮質(zhì)瘤中研究HIF表達(dá)，BHD(Birt-Hogg-Dubé)綜合征患者的嫌色細(xì)胞與嫌色細(xì)胞/嗜酸瘤細(xì)胞型腎腫瘤均一致性增強(qiáng)HIF-2α表達(dá)，HIF-1α表達(dá)也增強(qiáng)；來自遺傳性乳頭狀腎癌(MET原癌基因突變)的Ⅰ型乳頭中顯示大約一半有HIF-2α高表達(dá)，另有一半有HIF-1α表達(dá)。哺乳動(dòng)物西羅莫司靶蛋白及相關(guān)蛋白也是目前研究的熱點(diǎn)，且腎癌病理生理學(xué)的關(guān)鍵通道和磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白通道激活后可影響HIF的翻譯，在腎癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用。另有對FH基因剔除的小鼠腎囊腫研究發(fā)現(xiàn)，與選擇性FH/HIF-1α和FH/HIF-2α基因剔除相比，F(xiàn)H基因缺失性腎囊腫與HIF-1α活性相關(guān)，甚至與PHD酶失活也相關(guān)[12]。

1.6HIF通過活性轉(zhuǎn)錄靶基因促進(jìn)腎癌血管生成 腫瘤促進(jìn)自身血管生成的能力是腫瘤的重要特征，在腎癌含氧量正常的條件下HIF活化是腫瘤血管生成的關(guān)鍵因素；在HLRCC腫瘤生長過程中出現(xiàn)“假低氧”驅(qū)動(dòng)指令(活性氧類介導(dǎo)的HIF-α表達(dá))而進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞募集和血管化。低氧反應(yīng)異?；罨?，如VHL突變和HIF因子轉(zhuǎn)錄激活是腎癌中VEGF轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要機(jī)制。在VEGF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中對HIF-1α和HIF-2α的活進(jìn)行比較分析，HIF-1α主要作用在VEGF受低氧刺激后上調(diào)，而HIF-2α在腎臟腫瘤(VHL或FH突變)的VEGF激活，另外還轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞周期蛋白D1、轉(zhuǎn)化生長因子α[13]。促血管生成的很多分子的靶基因都由HIF活化，如血管生成素1、血管生成素4、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、干細(xì)胞生長因子等，它們與VEGF協(xié)同促進(jìn)血管生成，尤其是血管生成素和VEGF協(xié)同，主要表現(xiàn)為抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管穩(wěn)定[14]。

1.7Nrf2-FH基因失活研究新熱點(diǎn) 近年來，Nrf2活性在FH基因失活后影響的研究將逐漸成為熱點(diǎn)，F(xiàn)H失活必將導(dǎo)致大量延胡索酸集聚，而延胡索酸作為硫醇反應(yīng)復(fù)合物可在生理?xiàng)l件下與半胱氨酸殘基的部分硫醇反應(yīng)生成2-琥珀酸-半胱氨酸(2-succinyl-cysteine)[15]。目前將這種反應(yīng)命名為琥珀酸化(succination)，區(qū)別于蛋白琥珀?；?ssuccinylation)。琥珀酸化可調(diào)節(jié)大量含半胱氨酸殘基蛋白的活性，其中包含Keap1(Kelch-like ECH2 assiciated protein 1，Keap1)[16-18]。在正常生理狀態(tài)下，Keap1的雙甘氨酸序列與細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2結(jié)合，使其成為E3泛素連接酶的底物，促進(jìn)Nrf2泛素化被26S蛋白酶降解，故Nrf2維持在低水平。在氧化應(yīng)激源作用的條件下，Nrf2與Keap1解耦聯(lián)，進(jìn)入細(xì)胞核與基因中的Maf蛋白合成異二聚體，繼而識(shí)別并結(jié)合在抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)的GCTGAGTCA序列上，啟動(dòng)受ARE調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄。Nrf2-ARE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)節(jié)許多解毒酶的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑破壞與大量腫瘤發(fā)生有關(guān)，如肺癌、前列腺癌等[19-20]。

目前研究表明，Keap1可能是一個(gè)新的抑癌基因，Keap1的C237和C288兩個(gè)半胱氨酸殘基對Nrf2-Keap1復(fù)合物發(fā)揮重要穩(wěn)定性作用[21]，氧化Keap1 IVR(Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1)中的半胱氨酸硫醇即可導(dǎo)致其構(gòu)象改變。FH基因失活的組織中存在Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的過度表達(dá)，并證實(shí)FH基因失活細(xì)胞中Keap被琥珀酸化后引起Nrf-2的積聚和激活[12,22]。在基因表達(dá)分析的研究中，F(xiàn)H基因失活對Nrf-2活性發(fā)揮重要作用，F(xiàn)H基因失活組織中基因表達(dá)信號(hào)與Keap1基因剔除組織明顯重疊，且Nrf-2靶基因也出現(xiàn)過表達(dá)[22]。在FH突變在組織中血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)的表達(dá)及其酶活性增加，HO-1過度表達(dá)可促使腫瘤細(xì)胞增殖、抗氧化應(yīng)激、血管生成及病灶轉(zhuǎn)移。HO-1特異性抑制劑(如鋅原卟啉)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，在對HLRCC的研究中發(fā)現(xiàn)，HO-1基因可能是FH基因失活的治療靶點(diǎn)[23]。在一個(gè)替代模型的研究中發(fā)現(xiàn)，與Nrf2相關(guān)的HO-1表達(dá)調(diào)節(jié)被證實(shí)需完整的轉(zhuǎn)換/蔗糖不可發(fā)酵(SWItch/sucrose nonfermentable,SWI/SNF)復(fù)合體，多種環(huán)節(jié)的變異(SWI/SNF相關(guān)、核質(zhì)附著、肌動(dòng)蛋白依賴調(diào)節(jié)染色質(zhì)、SMARCA4)均可導(dǎo)致Nrf2和HO-1的表達(dá)解耦聯(lián)[24]。有報(bào)道稱，SWI/SNF復(fù)合體成分在腎癌突變的體細(xì)胞中普遍存在[25]。Shibata等[19]也發(fā)現(xiàn)在人類癌細(xì)胞中編碼Nrf-2的DLG序列發(fā)生體細(xì)胞突變，這些氨基酸序列突變導(dǎo)致Nrf-2在核內(nèi)累積并促進(jìn)了Nrf-ARE調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。目前尚沒有直接的證據(jù)顯示NRF激活是FH基因失活主要導(dǎo)致腫瘤的途徑，但是在人類癌細(xì)胞中的Nrf2的表達(dá)是顯著增加的，包括肺癌、乳腺癌及直腸癌等。除此之外，腎臟胚胎干細(xì)胞中的Nrf2活性被證實(shí)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，并為Nrf2的致瘤活性提供了有力證據(jù)。另有大量研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2可調(diào)節(jié)腫瘤組織中抗氧化酶的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的耐藥及生長活性增加[26]。Shibata等[19]還通過特異的小干擾RNA降低Nrf2表達(dá)水平逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥；與對照組相比，順鉑對轉(zhuǎn)染了Nrf2小干擾RNA的EBC-1(由過氧化物處理Nrf2突變的癌細(xì)胞)和A549細(xì)胞(Keap1突變癌細(xì)胞)的抗腫瘤增殖作用更明顯。Nrf2也參與FH基因失活腎囊腫中抗氧化反應(yīng)途徑，且其表達(dá)上調(diào)獨(dú)立于HIF-PHD酶活性通路[12]。

2 HLRCC的治療及預(yù)后

HLRCC發(fā)病早，臨床上女性患者子宮平滑肌肌瘤多在30歲前甚至更早發(fā)病，病情也較重；皮膚平滑肌瘤發(fā)病年齡也較??；遇見此類情況，應(yīng)該根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)反復(fù)詢問其家族史、吸煙史、月經(jīng)初潮及治療等，條件允許可通過基因工程相關(guān)技術(shù)對血液、皮膚、子宮腫瘤瘤體的FH基因進(jìn)行檢測。大多數(shù)專家建議此類患者需要篩查和盡早干預(yù)，多推薦從15歲開始，每年進(jìn)行腹部/盆腔CT或磁共振成像檢查一次。HLRCC的腎癌發(fā)病較早，具有侵襲性，確診后無論大小都建議行腎癌根治術(shù)。調(diào)節(jié)脯氨酰羥化酶活性抑制HIF(如R59949)的治療正在研究中。對于腎透明細(xì)胞癌，HIF-1α表達(dá)增高作為不良的預(yù)后因素，是一個(gè)獨(dú)立的生存率良好的預(yù)測指標(biāo)[27]。腫瘤高表達(dá)HIF-1α的患者的生存率(平均13個(gè)月)顯著低于低表達(dá)患者(平均24個(gè)月，P=0.005)。目前Nrf-ARE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已成為抗腫瘤藥物耐藥的新靶點(diǎn)，對Nrf2抑制即可有增敏癌細(xì)胞的能力也可改善抗癌藥物的敏感性。

3 結(jié) 語

HLRCC約占雖有腎臟惡性腫瘤3%，揭示和闡明這類綜合征的基因基礎(chǔ)，把握其生物學(xué)特征，不僅對治療遺傳性腎癌有重要意義，還可更好地認(rèn)識(shí)散發(fā)性腎癌的生物學(xué)基礎(chǔ)。由于HLRCC綜合征多以皮膚及子宮平滑肌瘤較早發(fā)病，而其腎癌具有明顯侵襲性，加強(qiáng)其生物學(xué)以及FH基因遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，提早干預(yù)，篩查及相關(guān)治療措施。

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