支氣管哮喘動(dòng)物模型建立及研究現(xiàn)狀

陳一平(綜述)，李超乾(審校)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,南寧 530021)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。近年來(lái)隨著生活方式改變及環(huán)境因素的影響，特別是在發(fā)達(dá)國(guó)家，哮喘發(fā)病、防治成本及疾病負(fù)擔(dān)有逐年增高的趨勢(shì)，據(jù)WHO最新報(bào)告，目前約有2.35億人受哮喘疾病影響[1]，因此哮喘的相關(guān)研究越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的重視和關(guān)注。哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，鑒于人體試驗(yàn)的局限性，有關(guān)哮喘發(fā)病機(jī)制的探索、新治療方法的評(píng)價(jià)、新藥研究與開(kāi)發(fā)都主要依賴(lài)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。隨著動(dòng)物模型研究的進(jìn)步和基因敲除及轉(zhuǎn)基因等技術(shù)的出現(xiàn)，使模型動(dòng)物的選擇和動(dòng)物模型的建立方法逐步改進(jìn)以達(dá)到盡可能模擬人類(lèi)哮喘疾病過(guò)程的目的，下面就支氣管哮喘的動(dòng)物模型的建立進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 小 鼠

其免疫遺傳背景清楚，品系純，來(lái)源廣，相關(guān)生物學(xué)試劑及抗體易獲得?？蓮?fù)制產(chǎn)生與人類(lèi)相似的氣道高反應(yīng)、氣道慢性炎癥、黏液增多等癥狀,并已有反應(yīng)氣道慢性炎癥過(guò)程的氣道重構(gòu)模型,雖然有體積小、操作及取材較困難，制作往往需要多次致敏和激發(fā)等缺點(diǎn)，目前仍為支氣管哮喘研究最為常用的動(dòng)物模型。常用的小鼠品系為BALB/c、C57BL/6，A/J、CBA、C3H等，以前兩種品系最常用。

1.1BALB/c小鼠 起源于小家鼠Mus musculus，1920年在紐約誕生，至今在全球研究機(jī)構(gòu)繁衍了超過(guò)200代，廣泛用于免疫學(xué)、生理學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，也是目前研究支氣管哮喘的主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)中常常選用6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g的雌性小鼠。對(duì)于不同種類(lèi)的哮喘模型，在制備方法上也有所差異，下面就以BALB/c小鼠為重點(diǎn)，分別闡述各類(lèi)哮喘模型的建立進(jìn)展。

1.1.1變態(tài)反應(yīng)性哮喘

1.1.1.1卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘發(fā)的支氣管哮喘模型 卵清蛋白因其免疫原性強(qiáng)、獲得方便，價(jià)格便宜成為目前研究最多、應(yīng)用最廣、技術(shù)也最成熟的誘喘劑，并常與佐劑合用建模，常用佐劑有氫氧化鋁、明礬、百日咳桿菌、抗酸桿菌、內(nèi)毒素等。目前最常用的造模方法是：第0天、第14天腹腔或皮下注射OVA致敏液0.2 mL/只(含OVA 100 μg)致敏，第21天開(kāi)始連續(xù)霧化吸入5%OVA激發(fā)，1次/d，30 min/次，連續(xù)霧化7 d以誘發(fā)哮喘。目前，在OVA的應(yīng)用劑量上湛孝東等[2]實(shí)驗(yàn)表明低濃度(10 mg/L)的OVA連續(xù)致敏小鼠造成過(guò)敏性哮喘病理改變較為明顯，高濃度(1000 mg/L)會(huì)導(dǎo)致模型免疫耐受。在激發(fā)方法上沈璐等[3]發(fā)現(xiàn)滴鼻激發(fā)建立的哮喘模型氣道炎癥及氣道反應(yīng)性升高更為顯著。在氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的研究上，謝佳星[4]發(fā)現(xiàn)平均中位直徑2.9 μm的霧化顆粒激發(fā)的小鼠的氣道反應(yīng)性明顯高于平均中位直徑8.6 μm的霧化顆粒激發(fā)的小鼠，但在氣道炎癥表現(xiàn)上無(wú)明顯差異，提示建立哮喘模型時(shí)注意變應(yīng)原的大小，并可以利用變應(yīng)原大小的不同建立具有明顯的嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥、但無(wú)氣道高反應(yīng)性的BALB/c小鼠模型。

1.1.1.2花粉誘發(fā)的支氣管哮喘模型 季節(jié)性哮喘的誘因中花粉和真菌占很大比例，建立此類(lèi)模型對(duì)研究變應(yīng)性哮喘有很大意義。李雅莉等[5]應(yīng)用葎草花粉粗浸液致敏激發(fā)的BALB/c小鼠建模，具體方法為：腹腔注射300 μg葎草花粉粗浸液加氫氧化鋁凝膠2 mg致敏，之后第7、14天后加強(qiáng)致敏，方法與劑量同上。第24天給予30μL(10 g/L)葎草花粉粗浸液滴鼻激發(fā)，每日1次，連續(xù)5次激發(fā)。王勝昱等[6]研究了在100、200、300 μg劑量下藜草花粉粗制變應(yīng)原腹腔致敏與滴鼻激發(fā)誘導(dǎo)的小鼠變態(tài)反應(yīng)氣管炎癥動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)劑量越高，癥狀及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)越明顯，病死率也越高。

1.1.1.3有機(jī)粉塵誘發(fā)的支氣管哮喘模型 有機(jī)粉塵種類(lèi)眾多，應(yīng)用于誘發(fā)的支氣管哮喘模型研究較多的是屋塵螨及蟑螂。最近國(guó)外相關(guān)屋塵螨所致哮喘模型的建立方法都是以鼻內(nèi)滴入屋塵螨3～6周[7-8]，朱艷芬等[9]研究了不同濃度致敏激發(fā)下小鼠支氣管哮喘氣道重構(gòu)模型存在明顯劑量效應(yīng)關(guān)系及時(shí)效關(guān)系，結(jié)果顯示高濃度屋塵螨提取物9周時(shí)氣道重構(gòu)表現(xiàn)最為明顯。

1.1.2感染性哮喘 采用比較多的是呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virues，RSV),內(nèi)毒素脂多糖等。蔣雄斌等[10]研究表明，RSV感染可致OVA致敏激發(fā)的哮喘小鼠呼吸道炎癥明顯加重，呼吸道反應(yīng)性顯著增加，且氣道高反應(yīng)性持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)。張雷英等[11]研究了感染時(shí)期對(duì)哮喘模型的影響，致敏前感染RSV明顯抑制OVA誘導(dǎo)的肺炎癥，RSV/OVA組小鼠肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減輕，但致敏后感染RSV則對(duì)OVA誘發(fā)的氣道變態(tài)炎癥無(wú)明顯影響。Newcomb等[12]則發(fā)現(xiàn)IL-17A基因敲除的小鼠比野生小鼠在經(jīng)OVA及RSV致敏激發(fā)的過(guò)程中表現(xiàn)出了更強(qiáng)烈的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥癥狀。

1.1.3職業(yè)性哮喘 此類(lèi)哮喘多為工作人員在生產(chǎn)環(huán)境中反復(fù)接觸有機(jī)酸酐所致，隨著全球工業(yè)化進(jìn)程的加快，逐步得到國(guó)際上中、美、英、德、日等國(guó)家重視。職業(yè)性哮喘的動(dòng)物模型多以小分子半抗原致敏。這組化合物包括鄰苯二甲酸酐、偏苯三酸酐(trimellitic anhydride，TMA)、六氫鄰苯二甲酸酐等，模型建立主要以大鼠及豚鼠為主。甲醛近年來(lái)在室內(nèi)污染研究中越來(lái)越受到重視，劉丹丹[13]發(fā)現(xiàn)雖然單獨(dú)的氣態(tài)甲醛致敏激發(fā)小鼠只能產(chǎn)生呼吸道嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)比率增加，不能誘發(fā)典型哮喘癥狀，但可以以類(lèi)似佐劑的作用加重哮喘小鼠模型癥狀。

1.2C57BL/6小鼠 源于艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株,1921年誕生，1985年引入中國(guó)。實(shí)驗(yàn)小鼠多選用鼠齡4～8周，體質(zhì)量在18～22 g之間，性別選擇要求不嚴(yán)，但為避免雄性小鼠為爭(zhēng)奪交配權(quán)而造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的浪費(fèi)，多數(shù)研究還是選擇雌性小鼠。國(guó)內(nèi)黃華瓊等[14]分別研究了5周齡開(kāi)始致敏9周齡激發(fā)、5周齡開(kāi)始致敏49周齡激發(fā)、45齡致敏49周齡激發(fā)的3組C57BL/6小鼠,發(fā)現(xiàn)早期致敏有利于哮喘模型的建立，致敏和激發(fā)的時(shí)間可影響炎癥的嚴(yán)重程度。同時(shí)，早致敏晚激發(fā)的方法可獲得穩(wěn)定的EOS炎癥、黏液高分泌和氣道高反應(yīng)的變化。Bogaert等[15]應(yīng)用OVA及弗氏佐劑致敏建立了長(zhǎng)久以來(lái)被忽視或誤解的中性粒細(xì)胞性哮喘小鼠模型。Corry等[16]在1996年就曾經(jīng)在研究中應(yīng)用OVA采取皮內(nèi)注射致敏、霧化吸入激發(fā)的方式成功建立了C57BL_6小鼠的哮喘模型，并發(fā)現(xiàn)了C57BL_6小鼠在氣道反應(yīng)性變化上不如balb_c小鼠。因此目前C57BL_6小鼠哮喘模型的應(yīng)用遠(yuǎn)比不上balb_c小鼠，少數(shù)應(yīng)用OVA建立C57BL_6小鼠哮喘模型的研究方法都與balb_c小鼠類(lèi)似，這里不再贅述。

由于C57BL_6小鼠對(duì)塵螨和豚草抗原反應(yīng)性較強(qiáng)，故在有機(jī)粉塵誘發(fā)的哮喘模型研究中應(yīng)用較多。常用造模方法：在實(shí)驗(yàn)第1天腹腔加皮下注射致敏劑50μL/只，第7天腹腔注射致敏劑50 μL。于第15～18天，用塵螨粗提浸液50μL/d，一次性緩慢滴鼻激發(fā)。在致敏方式的研究上，孔存權(quán)等[17]比較不同致敏方式在相同激發(fā)下的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)塵螨粗提浸液可以單獨(dú)應(yīng)用建立哮喘模型，但就穩(wěn)定性和成功率而言，加用佐劑或OVA更好。陳華夏[18]應(yīng)用了基因敲除技術(shù)建立模型動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)CXCR34基因敲除小鼠經(jīng)粉塵螨提取液致敏并激發(fā)的哮喘模型較野生C57BL_6小鼠模型肺部炎癥應(yīng)答更加嚴(yán)重。

2 大 鼠

大鼠品系純，來(lái)源廣，價(jià)格較便宜，有關(guān)分子生物學(xué)試劑較多，標(biāo)本采集量較充足，對(duì)抗原反應(yīng)性較為一致，能出現(xiàn)與人類(lèi)哮喘類(lèi)似的速發(fā)相及遲發(fā)相變態(tài)反應(yīng)，用大鼠制作哮喘動(dòng)物模型的技術(shù)也較成熟，大鼠基因組與人的基因組序列較為相似，大鼠體內(nèi)很多酶存在基因互補(bǔ)的抗體及探針，可以使對(duì)這些酶進(jìn)行的量化及定位研究更為直接，因而大鼠哮喘模型應(yīng)用也較多，國(guó)內(nèi)以Wistar大鼠、SD(Sprague Dawly)大鼠，BN(BrownNorway)大鼠為主。

2.1Wistar大鼠 1907年由美國(guó)wistar研究所育成。多選擇鼠齡6～8周，體質(zhì)量(200±50) g，常用造模方法為：即第1天及第7天將單只大鼠腹腔注射1% OVA 1 mg(含l%氫氧化鋁凝膠及6×106/L百日咳滅活菌苗混合液1 mL)致敏，第15天開(kāi)始霧化吸入2%OVA，連續(xù)7 d。魯燕霞[19]觀(guān)察了幼年(斷奶21 d)大鼠給予連續(xù)7 d束縛應(yīng)激及成年(9周)大鼠給予連續(xù)21 d束縛應(yīng)激后常規(guī)造模，提示心理應(yīng)激能加重Wistar大鼠哮喘模型氣道炎癥表現(xiàn)。喬永康[20]研究了甲醛(formaldehyde，F(xiàn)A)在大鼠哮喘模型中的作用，結(jié)果表明0.5 mg/m3和3.0 mg/m3的氣態(tài)FA暴露易化或惡化OVA誘導(dǎo)型哮喘。對(duì)于單獨(dú)應(yīng)用3.0 mg/m3FA組，一方面該組FA暴露可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠持續(xù)的氣道高反應(yīng)性，另一方面高濃度FA單獨(dú)暴露可能通過(guò)激活Th1類(lèi)免疫反應(yīng)和非EOS炎癥而誘發(fā)氣道高反應(yīng)性等哮喘樣癥狀。

2.2SD大鼠 1925年，美國(guó)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley)農(nóng)場(chǎng)用Wistar大鼠培育而成。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投噙x雄性SD大鼠，鼠齡6～8周，體質(zhì)量(200±20) g，常用造模方法為：大鼠則行OVA腹腔內(nèi)注射給藥，每隔7天1次，從第16天開(kāi)始大鼠進(jìn)行霧化吸入1% OVA，每次霧化30 min,共連續(xù)10 d吸入；張婷[21]在腹腔注射OVA致敏后以滴鼻和霧化的方法分別建立上下氣道炎性反應(yīng)。龔萍等[22]對(duì)比了不同方式哮喘激發(fā)發(fā)現(xiàn)，泵霧化激發(fā)方式優(yōu)于傳統(tǒng)的超聲霧化激發(fā)方式。SD大鼠是研究職業(yè)性哮喘的常用模型動(dòng)物，馮里[23]改進(jìn)了以往的造模方法：d1致敏：在大鼠背部?jī)蓚?cè)分4點(diǎn)皮內(nèi)注射0.15 mL含50%TMA的AOO(丙酮∶橄欖油=4∶1，體積比)溶液；d8致敏：兩耳背各皮下注射0.075 mL含25%TMA的AOO溶液；后6周每周1次霧化含TMA 60 mg的霧化液激發(fā)15 min，成功建立哮喘模型。同時(shí)對(duì)比研究了鄰苯二甲酸酐引發(fā)哮喘的比例不及TMA。

2.3BN大鼠 1930年Wistar研究所的King在野外捕獲的野生大鼠，并由King和Aptekman維持繁育，其中一個(gè)大鼠品系發(fā)生褐色突變，1958年Silvers和Billingham利用它們進(jìn)行兄妹交配并進(jìn)行組織相容性選擇后獲得。相較于前兩種品系的大鼠，BN大鼠應(yīng)用相對(duì)較少。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投噙xSPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200 g左右，目前常用為：d1皮下注射含OVA 100 μg、5×108個(gè)滅活百日咳桿菌疫苗和氫氧化鋁凝膠的生理鹽水混懸液1 mL，14 d后以5%的OVA生理鹽水溶液5 L/min霧化吸入5 min，激發(fā)哮喘發(fā)作，連續(xù)3次，每次間隔5 d[24]。

3 豚 鼠

豚鼠哮喘模型是最早及最經(jīng)典的動(dòng)物哮喘模型，在1976年就有應(yīng)用OAV建立豚鼠哮喘模型的報(bào)道[25]，后來(lái)隨著研究的深入文獻(xiàn)報(bào)道很多，Ressmeyer等[26]也認(rèn)為豚鼠在氣道藥理模型上比大鼠及小鼠更合適。因?yàn)橛糜陔嗍蟮臋z測(cè)試劑不多，尤其是抗體部分，這就限制了研究工作的開(kāi)展。而且豚鼠敏感性強(qiáng)，個(gè)體反應(yīng)差異大，對(duì)于致敏原不反應(yīng)或明顯反應(yīng)甚至死亡，影響造模成功率，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相對(duì)于小鼠和大鼠而言較為昂貴，會(huì)導(dǎo)致研究成本的增加，故近年來(lái)豚鼠用于支氣管哮喘建模有逐步減少的趨勢(shì)。試驗(yàn)豚鼠多數(shù)研究選擇雄性豚鼠，鼠齡25～35 d，體質(zhì)量(200±50) g，造模方法一般為：實(shí)驗(yàn)第1天腹腔注射10%的OVA1 mL，2周后把豚鼠置于密閉的玻璃霧化罩內(nèi)以l%的OVA霧化誘喘，每日1次直至哮喘典型癥狀出現(xiàn)。李海銀等[27]應(yīng)用OVA聯(lián)合弗氏佐劑致敏豚鼠建立了中性粒細(xì)胞哮喘的豚鼠模型。

4 其他哮喘模型動(dòng)物

除目前常用的大鼠、小鼠、豚鼠外還有一些相對(duì)大型的動(dòng)物可以選擇，例如貓可發(fā)生類(lèi)似于人類(lèi)慢性哮喘的支氣管疾?。获R可以形成以中性粒細(xì)胞升高為主的呼吸道疾病，它有哮喘的一些特點(diǎn)，可能與慢性阻塞性肺疾病的聯(lián)系更加密切；已知羊和犬對(duì)某些變應(yīng)原天生就敏感[28]，猴的免疫系統(tǒng)和人非常相似，但是存在動(dòng)物來(lái)源及實(shí)驗(yàn)成本的限制，研究與應(yīng)用都相對(duì)較少。

5 結(jié) 語(yǔ)

雖然目前支氣管哮喘的動(dòng)物模型可選的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物越來(lái)越多，針對(duì)不同誘因的哮喘建立模型的方法越來(lái)越完善，建立的動(dòng)物模型都出現(xiàn)了典型行為學(xué)表現(xiàn)，肺病理切片中的各種細(xì)胞、BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類(lèi)、EOS比率及相關(guān)生理功能指標(biāo)等都符合哮喘的疾病特征，但目前仍沒(méi)有哪種模型可以完全模擬人類(lèi)哮喘的疾病過(guò)程，所以為了弄清楚哮喘的發(fā)病機(jī)制并最終能更好的預(yù)防和治療支氣管哮喘，仍需在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立上更加努力。

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