二硫鍵氧化還原酶類似蛋白的研究進展

楊文靜(綜述)，胡文秀，方啟晨(審校)

(1.蘇州大學，江蘇 蘇州 215006； 2.上海市糖尿病研究所/上海市糖尿病重點實驗室/上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200233)

二硫鍵氧化還原酶類似蛋白(Disulfide-bond-A oxidoreductase-like protein,DsbA-L)又稱GST-Kappa或谷胱甘肽S轉移酶K1(glutathione S-transferase kappa 1,GSTK1)，具有谷胱甘肽-結合活性和谷胱甘肽-過氧化物酶活性。近年研究發(fā)現(xiàn)，它能與脂聯(lián)素相互作用，促進脂聯(lián)素的多聚化和分泌[1]。DsbA-L水平與肥胖癥以及內(nèi)質網(wǎng)應激呈負相關，并且能緩解由內(nèi)質網(wǎng)應激誘導的脂聯(lián)素水平下降。此外，DsbA-L基因多態(tài)性與胰島素分泌及脂肪分布相關。該文從DsbA-L結構、功能及其與脂聯(lián)素之間的關系等幾個方面綜述如下。

1 DsbA-L的發(fā)現(xiàn)及結構特點

DsbA-L即GSTK1，由Harris等[2]從大鼠肝臟線粒體基質中分離純化獲得，研究發(fā)現(xiàn)它有谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase,GSTs)活性，并與可溶性GSTs中Theta類成員GST12-12存在36%的相似性，被歸于GSTs家族的Theta類，用GST13-13表示。1996年Pemble等[3]對大鼠GST13-13的cDNA進行分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與GSTs的其他成員相比同源性甚低，且缺乏可溶性GSTs成員所共有的SNAIL∕TRAIL(Ser-Asn-Ala-Ile-Leu/Thr-Arg-Ala-Ile-Leu)基序，故將GST13-13作為GSTs家族新的一類，GST-Kappa。

然而，對GSTs基因家族進行結構和功能分析發(fā)現(xiàn)，GSTK1基因不屬于GSTs基因家族成員[4]，并且GSTK1與細菌的2-羥基苯并氫(化)吡喃-2-羧化鹽(2-hydroxychromene-2-caboxylate,HCCA)異構酶和二硫鍵氧化還原酶A(Disulfide-bond A oxidoreductase，DsbA)在一級序列和二級結構上有較高的同源性[5-6]。DsbA是硫氧還原蛋白家族的一個亞族，在細菌的分泌蛋白折疊過程中具有催化二硫鍵形成的作用[7]，而HCCA異構酶也屬于DsbA家族，涉及原核生物多芳烴代謝分解通路[8]。晶體結構分析同樣顯示，GSTK1和DsbA具有相似的三維結構，且與其他GSTs家族成員顯著不同[6]。2008年Liu等[1]研究發(fā)現(xiàn),GSTK1在促進脂聯(lián)素多聚化和分泌方面具有關鍵作用，結合既往的研究結果，將其重新命名DsbA-L。

DsbA-L是相對分子質量為25×103的二聚體[2]。類似于真核生物的蛋白二硫鍵異構酶，DsbA-L包含兩個硫氧還蛋白樣(thioredoxin-like)結構域，但缺乏DsbA家族成員所共有CXXC(C：半胱氨酸；X：任何氨基酸)活性中心，而該活性中心在二硫鍵的氧化形成和還原異構過程中起關鍵作用。值得注意的是，DsbA-L在相應于DsbA的這個CXXC氧化還原活性中心的地方則存在一個SXXS(S：絲氨酸；X：任何氨基酸)序列[1]，此序列在人、大鼠、小鼠及線蟲等物種間相當保守，提示SXXS序列存在重要功能。

2 DsbA-L基因及其組織表達

大鼠和小鼠的DsbA-L基因分別位于染色體4q23和6B2.1，均由8個外顯子組成，其編碼蛋白的DNA長度分別為4.3 kb和4.1 kb，此兩個種屬的DsbA-L基因的外顯子序列、外顯子側翼的拼接點序列以及內(nèi)含子的長度高度相似[9]。人的DsbA-L基因位于染色體7q34，也包含8個外顯子，全長5.68 kb[9]。人GSTK1基因編碼區(qū)與大鼠和小鼠GSTK1的cDNAs的同源性為77%，然而人DsbA-L基因5′端非編碼區(qū)序列與嚙齒類動物之間無同源性，提示人與嚙齒類動物DsbA-L表達可能存在不同的調(diào)控機制[10]。對小鼠GSTK1基因的啟動子區(qū)域進行研究發(fā)現(xiàn)，在翻譯起始點上游的-971～-111 bp片段是小鼠GSTK1基因的啟動子的重要區(qū)域[11]。

Jowsey等[9]發(fā)現(xiàn)大鼠和小鼠DsbA-L的信使RNA(mRNA)在心、肝、腎和骨骼肌中高表達，在腦和肺則為低表達，而在脾臟和睪丸中表達水平最低。Thomson等[12]對小鼠肝臟及腎臟樣本的電鏡分析顯示，DsbA-L位于其肝臟和腎臟細胞的線粒體上。人DsbA-L的mRNA在組織中普遍表達，在肝臟、腎臟和前列腺中較豐富；進一步的體外研究顯示，人DsbA-L蛋白在細胞的過氧化物酶體和線粒體表達[10]。2008年Liu等[1]發(fā)現(xiàn)，GSTK1蛋白在小鼠和人的脂肪組織中均為高表達，且表達水平在肥胖時顯著下降。

3 DsbA-L與脂聯(lián)素

脂聯(lián)素是一種由脂肪細胞分泌的脂肪因子，具有增強胰島素敏感性，抗炎和抗動脈粥樣硬化等多種功能。脂聯(lián)素含有膠原樣結構域和球形結構域，在血漿中它以低相對分子質量的三聚體、中等相對分子質量的六聚體和高相對分子質量的多聚體三種形式存在。脂聯(lián)素通過其球形結構域形成三聚體，兩個三聚體通過第39位半胱氨酸間的二硫鍵形成六聚體，六聚體作為一個結構單位以束狀樣結構形成由12～18個六聚體組成的多聚體[13]。不同的多聚體具有不同的生物學作用，研究表明高相對分子質量多聚體是脂聯(lián)素代謝作用的主要活性形式[15]。脂聯(lián)素的多聚化受損不僅可導致其分泌和功能的缺陷，而且與2型糖尿病及胰島素敏感性關系密切[13-15]。脂聯(lián)素生物合成與分泌的調(diào)控機制目前尚不明確。

2008年Liu等[1]發(fā)現(xiàn)，DsbA-L與脂聯(lián)素之間存在相互作用，在前脂肪細胞分化為脂肪細胞的過程中DsbA-L和脂聯(lián)素的表達同時顯著增加。在3T3-L1脂肪細胞中過度表達DsbA-L可增加高相對分子質量脂聯(lián)素水平，并促進脂聯(lián)素的分泌；通過RNA干擾技術抑制DsbA-L的表達，則導致脂聯(lián)素表達及分泌減少、高相對分子質量脂聯(lián)素與低相對分子質量脂聯(lián)素比值顯著降低，而且這個抑制作用對脂聯(lián)素是特異的，對其他脂肪因子(如廋素和抵抗素)的表達水平并無顯著影響。研究還發(fā)現(xiàn)，DsbA-L的SXXS保守序列(16Ser-Pro-Tyr-19Ser)對其調(diào)控脂聯(lián)素多聚化具有關鍵性的作用，Ser16的突變可阻止DsbA-L與脂聯(lián)素的結合，影響DsbA-L對高相對分子質量脂聯(lián)素形成的促進用[1]。這些結果提示：DsbA-L與脂聯(lián)素的關系密切，在脂聯(lián)素的形成和分泌中扮演重要角色。

一系列研究顯示，噻唑烷二酮類(thiazolidinediones，TZDs)藥物可以提高血漿脂聯(lián)素水平[16-17]。TZDs是過氧化物酶體增生激活受體 γ(peroxisome proliferatoractivated receptor γ,PPARγ)的配體，可激活核轉錄因子PPARγ從而調(diào)節(jié)基因的轉錄。PPARγ被認為是促進脂聯(lián)素生物合成的調(diào)節(jié)因子，其確切機制尚不十分明確。有研究顯示，TZDs促進高相對分子質量的脂聯(lián)素合成及分泌增加，而對脂聯(lián)素的mRNA水平無影響，提示TZDs誘導的脂聯(lián)素水平增高可能發(fā)生在翻譯后水平[18-19]。Liu等[1]發(fā)現(xiàn)，TZDs 在增加DsbA-L表達的同時，也使高分子質量脂聯(lián)素的形成以及脂聯(lián)素的分泌增加，而且DsbA-L表達改變對脂聯(lián)素的mRNA水平無顯著影響；研究還發(fā)現(xiàn)，DsbA-L促進脂聯(lián)素的分泌和多聚化，而對于存在二硫鍵形成缺陷的脂聯(lián)素(C39S突變脂聯(lián)素)，DsbA-L既不能增加此突變脂聯(lián)素的表達，也不能促進其多聚化。因此，DsbA-L可能作為分子伴侶或蛋白折疊催化酶調(diào)節(jié)脂聯(lián)素的組裝和分泌。TZDs通過激活PPARγ上調(diào)DsbA-L，由此提供有利于蛋白折疊的環(huán)境，從而促進脂聯(lián)素的多聚化以及分泌。

最近發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以促進脂聯(lián)素的多聚化和表達[20]。研究顯示，白藜蘆醇上調(diào)DsbA-L的mRNA水平，但對脂聯(lián)素的mRNA水平無顯著影響[20]。提示白藜蘆醇是通過調(diào)控DsbA-L的表達，從而增強脂聯(lián)素的多聚化及分泌。

4 DsbA-L與內(nèi)質網(wǎng)應激

內(nèi)質網(wǎng)是蛋白質合成與翻譯后修飾、多肽鏈正確折疊與裝配及轉運的重要場所。來自內(nèi)質網(wǎng)上核糖體的新生肽鏈進入內(nèi)質網(wǎng)管腔，經(jīng)過信號肽切除、N-糖基化修飾、二硫鍵形成、與分子伴侶結合等，折疊成穩(wěn)定的二級及三級結構。內(nèi)質網(wǎng)的氧化環(huán)境以及在其中的多種蛋白分子伴侶對于膜蛋白和分泌蛋白(如胰島素、脂聯(lián)素)的正確折疊和裝配是必需的[21]。很多因素(如低氧、脂質過度負荷、化學毒素等)可導致內(nèi)質網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，形成內(nèi)質網(wǎng)應激。內(nèi)質網(wǎng)應激與肥胖、糖尿病關系密切。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖會誘導內(nèi)質網(wǎng)應激，且內(nèi)質網(wǎng)應激與脂聯(lián)素水平降低相關[22]，在肥胖、2型糖尿病患者中血漿脂聯(lián)素水平顯著降低[23]，然而肥胖以及內(nèi)質網(wǎng)應激在下調(diào)脂聯(lián)素中的作用目前仍不明確。

DsbA-L是目前發(fā)現(xiàn)的與脂聯(lián)素存在相互作用的蛋白之一，可促進脂聯(lián)素的多聚化和分泌。DsbA-L在脂肪組織高度表達，但在肥胖小鼠和人的脂肪組織中DsbA-L表達均顯著降低[1]，那么DsbA-L與肥胖所致的低脂聯(lián)素血癥與內(nèi)質網(wǎng)應激之間是否存在聯(lián)系？2010年Zhou等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠和高脂飲食誘導的肥胖小鼠均存在內(nèi)質網(wǎng)應激，其血清脂聯(lián)素水平以及脂肪組織中DsbA-L表達水平顯著降低；用?；切苋パ跄懰峋徑鈨?nèi)質網(wǎng)應激后，db/db小鼠和高脂誘導的肥胖小鼠的低血清脂聯(lián)素水平和DsbA-L低表達均得到改善。細胞水平的研究顯示，內(nèi)質網(wǎng)應激可下調(diào)DsbA-L的表達，并且影響3T3-L1脂肪細胞的脂聯(lián)素水平及其分泌[24]。在3T3-L1脂肪細胞中過表達DsbA-L，則可緩解內(nèi)質網(wǎng)應激以及內(nèi)質網(wǎng)應激所致的脂聯(lián)素水平下降和高相對分子質量脂聯(lián)素的降低；在3T3-L1脂肪細胞中用RNA干擾抑制DsbA-L表達，可致細胞發(fā)生內(nèi)質網(wǎng)應激、脂聯(lián)素水平以及高分子質量脂聯(lián)素顯著降低[24]。這些結果提示，內(nèi)質網(wǎng)應激在肥胖誘導的脂聯(lián)素下調(diào)中具有重要作用，DsbA-L促進脂聯(lián)素的裝配和穩(wěn)定性，并且改善內(nèi)質網(wǎng)應激對脂聯(lián)素多聚化和分泌水平的影響。肥胖引起的DsbA-L降低，可能導致內(nèi)質網(wǎng)中錯誤折疊的脂聯(lián)素增加，從而影響高分子質量脂聯(lián)素的形成和分泌。

5 DsbA-L基因變異與糖脂代謝

2009年Gao等[25]根據(jù)HapMap計劃公布的中國人單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫和美國國立生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，選擇DsbA-L基因的一個單核苷酸多態(tài)位點-1308G→T，在1045例上海地區(qū)社區(qū)人群中對該變異與2型糖尿病和肥胖及其中間性狀進行了關聯(lián)研究。結果發(fā)現(xiàn)，-1308G→T不僅與體脂分布相關，而且與胰島素分泌相關。然而，在研究中未發(fā)現(xiàn)-1308G→T變異與血清脂聯(lián)素水平以及高分子質量脂聯(lián)素水平相關。由于脂聯(lián)素的生物合成及分泌和多種因素(如肥胖、內(nèi)質網(wǎng)應激、脂聯(lián)素基因變異等)有關，DsbA-L基因變異在其中可能僅是微效作用，變異與脂聯(lián)素的相關性需要在更大人群中作進一步研究。2010年Shield等[26]報道，對194例不同種族人群(94例高加索人、50例非洲人及50例中國人)DsbA-L基因變異檢測，僅發(fā)現(xiàn)在5′端非編碼區(qū)存在兩個單核苷酸多態(tài)位點：-1308G→T和-1032 G→C；進一步的研究發(fā)現(xiàn)在-1308處存在一個法呢醇X受體/視黃醇X受體轉錄因子結合位點，-1308G→T的變異使得DsbA-L基因啟動子活性在人肝癌細胞增加了55%，而在人胚腎293細胞則降低了59%。這個在不同細胞系存在不同影響的結果提示，-1308G→T變異可能是調(diào)控DsbAL表達以及DsbAL作用發(fā)揮的一個重要遺傳調(diào)節(jié)因素。此外，-1032 G→C變異改變了DsbAL基因的甲基化位點，-1032C容易發(fā)生甲基化；-1032G→C的變異導致DsbAL轉錄活性在人肝癌細胞和人胚腎293細胞均下降38%。

6 展 望

肥胖癥、糖尿病等代謝性疾病是由基因及環(huán)境因素共同參與、相互作用的復雜病，與糖脂代謝紊亂、炎性反應和細胞應激等關系密切。脂聯(lián)素具有抗動脈粥樣硬化、抗炎、降血糖及增強胰島素敏感性等特點，對糖、脂代謝的調(diào)節(jié)具有重要作用，在治療2型糖尿病和肥胖方面有廣泛的前景。DsbA-L是近年發(fā)現(xiàn)的一個調(diào)節(jié)脂聯(lián)素的多聚化的關鍵蛋白，并可以緩解由于內(nèi)質網(wǎng)應激誘導的脂聯(lián)素水平下降。因此，DsbA-L是一個具有廣泛前途的藥物新靶點，對于其作用機制的深入研究將為治療各種代謝疾病提供一個新的途徑。

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