卒中后抑郁細(xì)胞因子蛋白組學(xué)初探

耿磊鈺，唐浩，李文平，錢方媛，錢俊峰，李凌江，張志

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中后常見并發(fā)癥之一。約有1/3卒中患者在卒中后不同階段罹患PSD[1]。PSD嚴(yán)重阻礙卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)，增加病死率、致殘率，降低患者生存質(zhì)量，增加社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。目前對PSD發(fā)病機(jī)制認(rèn)識不一，有學(xué)者提出，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)失衡是PSD的可能生物學(xué)病因[3]。已有研究顯示，白細(xì)胞介素6（interleukin 1，IL-6）、白細(xì)胞介素18（interleukin 18，IL-18）及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）等促炎因子水平在PSD患者中呈顯著改變[4]。既往研究僅限于以上極少數(shù)細(xì)胞因子分析，缺乏系統(tǒng)性和全面性。本研究旨在利用蛋白組學(xué)方法系統(tǒng)觀察卒中后急性期患者血漿中120種細(xì)胞因子水平與卒中后2周時PSD發(fā)生之間的關(guān)系，為PSD的細(xì)胞因子發(fā)病假說提供臨床證據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究對象均來自于2010年10月～2011年3月入住于我院神經(jīng)內(nèi)科的急性缺血性卒中患者，隨訪至卒中后2周，依據(jù)美國精神病學(xué)會《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊》第4版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-Ⅳ，DSM-Ⅳ）[5]標(biāo)準(zhǔn)診斷PSD，即患者必須同時表現(xiàn)心境低落，或興趣或快感缺失以及至少4項其他抑郁癥狀，并持續(xù)2周以上。入組標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病后3 d內(nèi)入院的急性缺血性卒中患者；②年齡大于18歲；③卒中診斷符合1995年全國第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會議制定的《各類腦血管病診斷要點》[6]中有關(guān)腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并均經(jīng)頭顱磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）證實；④隨機(jī)選擇符合PSD診斷及非PSD患者各12例納入本實驗進(jìn)行細(xì)胞因子蛋白水平檢測；⑤患者本人及家屬簽署書面知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①因意識、視力、聽力、嚴(yán)重語言表達(dá)及理解障礙，無法完成檢查者；②合并腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血及短暫性腦缺血發(fā)作患者；③伴有帕金森病、癲癇、神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病患者；④伴有嚴(yán)重軀體疾病者，包括心肝腎功能不全、休克、惡性腫瘤或血液病、自身免疫性疾病等；⑤既往有抑郁癥病史及器質(zhì)性精神疾病病史，近1年內(nèi)有重大精神創(chuàng)傷史者；⑥近1個月內(nèi)有藥物、酒精及其他物質(zhì)依賴或濫用者；⑦近1個月內(nèi)發(fā)生感染或傳染性疾病者。

住院期間，所有患者均行頭顱MRI檢查，以彌散加權(quán)像（diffusion-weighted imaging，DW I）序列所見明確急性梗死病灶為標(biāo)準(zhǔn)，測定梗死中心距額極直線距離。利用公式（a×b×c×0.5）/2[7]計算梗死灶體積（單位：cm3），其中a為梗死面積最大層面上病灶的最大橫徑，b為梗死面積最大層面上病灶的最大長徑，c為梗死病灶累計層數(shù)，層厚為0.5 cm。影像學(xué)指標(biāo)測量及計算由兩名影像專業(yè)主治醫(yī)師進(jìn)行，取其平均值。

所有納入本研究的卒中患者均接受了同等劑量抗血小板聚集藥物治療（阿司匹林100 mg/d）。本研究經(jīng)東南大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料收集及評估 本研究小組由經(jīng)過培訓(xùn)的神經(jīng)內(nèi)科和精神科醫(yī)生組成，所有的臨床量表評估及PSD診斷均由2名高年資醫(yī)師共同完成，如存有異議時會商確定。收集及評估以下臨床資料：①一般資料：現(xiàn)病史、既往史、卒中危險因素包括高血壓[8]、糖尿病[9]、卒中病史[6]、吸煙、飲酒史等。本研究中根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）關(guān)于吸煙情況調(diào)查方法的標(biāo)準(zhǔn)化建議將吸煙定義為：每天吸煙卷1支以上，連續(xù)或累計6個月[10]； 飲酒定義為：每周至少1次，連續(xù)6個月以上飲酒者；②神經(jīng)功能評估：入院時及發(fā)病2周后兩次進(jìn)行神經(jīng)功能評估，以美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評定神經(jīng)功能缺損程度，Barthel指數(shù)評估功能殘疾水平；③認(rèn)知功能：卒中后2周，以簡易精神狀態(tài)檢查量表（Mini-Mental State Examitation，MMSE）評定認(rèn)知功能；④抑郁癥狀：卒中后2周，分別以漢密爾頓抑郁量表（the 17-item Hamilton Depression Rating Scale，HAMD）及漢密爾頓焦慮量表（Hamilton Anxiety Scale，HAMA）評估患者抑郁癥狀及焦慮癥狀嚴(yán)重程度。

1.3 血漿細(xì)胞因子抗體芯片測定 患者入院后1 d清晨［卒中后（1.5±0.9）d］空腹留取靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA）試管抗凝，3000 rpm離心20 min，留取并分裝血漿樣本，凍存于－80℃冰箱待檢。利用人類細(xì)胞因子蛋白表達(dá)微陣列芯片（Human Cytokine Antibody Array G-Series 1000）進(jìn)行血漿中共120種細(xì)胞因子蛋白水平檢測，以質(zhì)控血漿做重復(fù)檢驗，檢測峰值及強度的變異系數(shù)均控制在誤差范圍內(nèi)。并隨機(jī)挑取10%細(xì)胞因子以酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）進(jìn)行驗證檢測，對實驗室檢測者及結(jié)果觀測者均實行盲法（北京博奧生物有限公司）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，計量資料采用單樣本K-S正態(tài)性檢驗，對符合正態(tài)分布的資料，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；對不符合正態(tài)分布的資料，以中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。細(xì)胞因子抗體芯片信號強度經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后，點信號強度（spot signal intensity，SIs）表達(dá)差異＞1.5倍者，以Mann-Whitney U檢驗比較兩組之間信號強度差別，QValue 1.0軟件進(jìn)行錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）多重校正。采用二元多因素Logistic向前逐步回歸分析法評估細(xì)胞因子對卒中后急性期PSD發(fā)病的影響。正態(tài)性資料采用Pearson相關(guān)分析，非正態(tài)性資料采用Spearman非參數(shù)相關(guān)檢驗進(jìn)行各因素間關(guān)聯(lián)分析。以P＜0.05為差異具有顯著性。

“老板”成為當(dāng)前一些研究生對自己導(dǎo)師的稱呼，這其實是對師生教育關(guān)系功利化的折射?！皩?dǎo)師利用學(xué)生做科研，學(xué)生利用導(dǎo)師拿學(xué)位”正成為教育關(guān)系極端功利化的丑陋寫照，導(dǎo)致師生關(guān)系嚴(yán)重異化。具體而言，教育關(guān)系的功利化主要有如下表現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 PSD組與非PSD組一般臨床資料比較 PSD組與非PSD組一般人口學(xué)資料、既往病史、病灶特征、神經(jīng)功能比較均無顯著性差異。兩組患者卒中后兩周HAMD評分（P＜0.001）及HAMA評分（P＜0.001）差異均有顯著性（表1）。

2.2 PSD組與非PSD組血漿細(xì)胞因子蛋白水平比較 120種血漿細(xì)胞因子中，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3β（macrophage inflammatory protein-3 beta，MIP-3 beta）、胰島素樣生長因子1受體（insulinlike growth factor 1 receptor，IGF-I SR）、胎盤生長因子（placental growth factor，PIGF）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）4種細(xì)胞因子蛋白SIs在PSD組明顯低于非PSD組，單因素分析中具有統(tǒng)計學(xué)差異，但均未能通過多重校正（表2）。

2.3 PSD相關(guān)細(xì)胞因子的多因素Logistic回歸分析 將單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的4種血漿細(xì)胞因子引入回歸方程中，多因素Logistic回歸分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何細(xì)胞因子蛋白SIs與卒中后兩周PSD發(fā)生獨立相關(guān)。

2.4 細(xì)胞因子蛋白SIs與抑郁、焦慮嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 PSD患者血漿IGF-I SR SIs與入院時Barthel指數(shù)評分呈顯著負(fù)相關(guān)（r=－0.641，P=0.025）（圖1），與卒中后兩周HAMD（r=0.478，P=0.005）及HAMA評分（r=0.674，P=0.016）呈顯著正相關(guān)（圖2）。未發(fā)現(xiàn)其他因子與焦慮或抑郁嚴(yán)重程度有相關(guān)性。

3 討論

本研究系統(tǒng)觀察并分析了缺血性卒中患者急性期血漿120種細(xì)胞因子蛋白水平與卒中2周后PSD發(fā)生的關(guān)系。研究結(jié)果提示，在單因素分析中，PSD患者卒中后急性期血漿中4種細(xì)胞因子蛋白SIs顯著低于非PSD患者，且血漿IGF-I SR SIs與入院時神經(jīng)功能缺損程度及卒中2周后抑郁、焦慮嚴(yán)重程度均存在顯著相關(guān)性。

表1 PSD組和非PSD組人口學(xué)資料及一般臨床資料比較

表2 PSD組和非PSD組血漿差異表達(dá)細(xì)胞因子點信號強度比較

圖1 卒中后抑郁患者血漿胰島素樣生長因子1受體蛋白（IGF-I SR）點信號強度與入院時Barthel指數(shù)評分呈負(fù)相關(guān)統(tǒng)計圖

圖2 卒中后抑郁患者血漿胰島素樣生長因子1受體蛋白（IGF-I SR）點信號強度與入院后2周漢密爾頓抑郁量表（HAMD）及漢密爾頓焦慮量表（HAMA）統(tǒng)計圖。圖A為IGF-I SR點信號強度與入院后2周HAMD呈正相關(guān)統(tǒng)計圖；圖B為IGF-I SR點信號強度與入院后2周HAMA呈正相關(guān)統(tǒng)計圖

細(xì)胞因子是一類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽的總稱，根據(jù)細(xì)胞因子主要的功能可分為白細(xì)胞介素、集落刺激因子、干擾素、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β家族、生長因子、趨化因子家族共7大類[11]。但目前對于PSD與細(xì)胞因子之間的研究多限于IL-6、IL-18、TNF-α等少數(shù)促炎因子[4]，缺乏各類細(xì)胞因子全面、同步、系統(tǒng)的研究結(jié)果。以細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)為依托的蛋白組學(xué)技術(shù)，具有快速、簡易、高通量的優(yōu)點，為篩選與疾病相關(guān)的潛在細(xì)胞因子生物學(xué)標(biāo)志物提供了良好平臺[12-13]。本研究嚴(yán)格篩選了符合入組標(biāo)準(zhǔn)的卒中急性期PSD患者作為研究對象；細(xì)胞因子蛋白芯片的自動操作，避免了人為的操作誤差；質(zhì)控血漿、檢測變異系數(shù)的嚴(yán)格控制及隨機(jī)樣本的平行重復(fù)驗證確保了檢測準(zhǔn)確性，以上均為本研究結(jié)果的可靠性提供了良好保障。

本研究發(fā)現(xiàn)4種細(xì)胞因子蛋白SIs在PSD組明顯低于非PSD組。值得關(guān)注的是，除MIP-3 beta參與炎癥反應(yīng)外，另外3種均歸屬于生長因子亞族，分別為PIGF、VEGF及IGF-I SR。已有研究證實，VEGF與PIGF具有高度同源堿基序列，PIGF作為一種分泌型同型二聚體糖蛋白，因最初在人類胎盤中發(fā)現(xiàn)而命名，被認(rèn)為是VEGF家族中的一員，二者功能具有相似性[14]。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)IGF-I SR蛋白血漿SIs在PSD組顯著低于非PSD組，且PSD患者血漿IGF-I SR蛋白信號強度越高，入院時神經(jīng)功能缺損程度及2周后抑郁、焦慮癥狀越重。IGF-I是由70個氨基酸殘基組成的多肽，主要在肝臟合成，IGF-I可以穿過血腦屏障與其受體相結(jié)合。其受體IGF-I SR主要分布在大腦皮質(zhì)的表層和深層，嗅球，丘腦核和海馬等處，神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)亦表達(dá)IGF-I SR，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等多種生物活性[21-22]。此前IGF-I SR與精神分裂癥的關(guān)系已引起學(xué)者的關(guān)注[23]，李則摯等[24]和易正輝等[25]利用全基因組外周血基因表達(dá)譜芯片分析顯示IGF-I SR基因在亞綜合征抑郁（subsyndromal symptomatic depression，SSD）中表達(dá)下降，且SSD患者外周血IGF-I SR基因mRNA表達(dá)水平比正常對照組降低17.63%，有統(tǒng)計學(xué)差異。以上發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實IGF-I SR與抑郁發(fā)病相關(guān)。此外，更有學(xué)者指出，IGF-I與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子協(xié)同使用具有更顯著的促進(jìn)海馬再生及抗抑郁效果，甚至有研究發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子抗抑郁療效具有IGF-I依賴性[26]。

本研究存在一定局限性。首先，樣本量偏小，導(dǎo)致統(tǒng)計效力不足；其次，隨訪期僅至卒中后2周，對PSD的診斷存在一定時間局限性；第三，卒中急性期細(xì)胞因子干擾因素復(fù)雜，可能造成檢測結(jié)果偏倚。

綜上所述，本研究初步探討了缺血性卒中后急性期血漿細(xì)胞因子水平與卒中后2周時PSD發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果提示，PSD患者卒中后急性期血漿中4種細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平異常，但未能通過多重校正。因此，卒中急性期血漿細(xì)胞因子水平尚不能作為預(yù)測PSD發(fā)生的獨立危險因素，但3種生長因子水平的異常提示PSD可能存在突觸可塑及神經(jīng)再生障礙。本研究結(jié)論尚需在大樣本研究中進(jìn)一步驗證。

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