兩種美托洛爾緩釋片在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)對比研究

李后濤，厲保秋，黃桂華，任文剛，高希波，房世紅

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012；2.山東弘立醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究有限公司，山東濟(jì)南250012；3.山東齊都藥業(yè)有限公司，山東淄博255000）

兩種美托洛爾緩釋片在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)對比研究

李后濤1，3，厲保秋1，黃桂華1，任文剛3，高希波3，房世紅2

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012；2.山東弘立醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究有限公司，山東濟(jì)南250012；3.山東齊都藥業(yè)有限公司，山東淄博255000）

目的研究富馬酸美托洛爾緩釋片的藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為和緩釋特性，并與已上市琥珀酸美托洛爾緩釋片對比。方法采用隨機(jī)交叉自身對照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對12只健康比格犬（雌雄各半）先后單次和多次灌胃富馬酸美托洛爾緩釋片（T藥）和琥珀酸美托洛爾緩釋片（R藥）。采用LC－MS／MS法測定血藥濃度；采用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)；采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明單次和多次口服給藥，兩種緩釋片的AUC，t1／2，Tmax以及Cmax無顯著性差異，生物等效.結(jié)論富馬酸美托洛爾緩釋片具有良好的緩釋性。

富馬酸美托洛爾；緩釋片；高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法；藥代動(dòng)力學(xué)

富馬酸美托洛爾（metoprolol fumarate，MF）為美托洛爾的富馬酸鹽，其原料藥己收載于美國藥典和歐洲藥典，是一種β1受體阻滯劑，β1／β2的選擇性約75倍。于1969年在瑞典的Hassle實(shí)驗(yàn)室研發(fā)成功，自1975年阿斯利康公司以“倍他樂克”商品名上市以來，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于高血壓和缺血性心臟病、慢性穩(wěn)定性心力衰竭、心律失常等多種心血管疾病患者的治療。目前國內(nèi)上市的美托洛爾多為其酒石酸鹽、琥珀酸鹽，已有藥學(xué)、藥代比較研究支持琥珀酸鹽較酒石酸鹽更適合開發(fā)成緩釋片，美國藥學(xué)科學(xué)家協(xié)會(huì)官方刊物Pharmaceutical Research報(bào)道，富馬酸美托洛爾緩釋片、琥珀酸美托洛爾緩釋片具有生物等效性，且與酒石酸美托洛爾相比，兩個(gè)緩釋產(chǎn)品均具有顯著地緩釋特性。MF在胃腸道具有高溶解性、高滲透性［1，2］。高血壓、心絞痛等疾病的發(fā)病高峰期為凌晨，對于老年人來說，起床服藥極為不便［3～5］。因此如果將MF制成一天給藥一次的緩釋片，不但可以有效克服上述問題，還有望減小血藥濃度波動(dòng)，減少給藥次數(shù)，降低不良反應(yīng)，從而提高病人順應(yīng)性。所以我們進(jìn)行了富馬酸美托洛爾緩釋片的研究，為了評價(jià)富馬酸美托洛爾緩釋片與琥珀酸美托洛爾緩釋片在藥代動(dòng)力學(xué)方面的異同，我公司

委托山東弘立醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究有限公司進(jìn)行非臨床試驗(yàn)研究。采用液相－二級質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS／MS）法對比格犬富馬酸美托洛爾緩釋片與琥珀酸美托洛爾緩釋片單、多次灌胃給藥的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行對比研究［6，7］，以驗(yàn)證該制劑的緩釋特征，以期為MF的該種制劑的臨床開發(fā)及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器、試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1 儀器 TCS－150A（731型）電子計(jì)重計(jì)數(shù)稱；Agilent1200液相系列：G1329A柱溫箱；G1311A自動(dòng)進(jìn)樣器；G1322A泵；Agilent 6410三重四級桿質(zhì)譜；XW－80A漩渦混合儀；Milli－Q超純水機(jī)；Mettler Toler AL204電子天平；H1850臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；海爾DW－86L386超低溫冰箱；LD5－2A離心機(jī)。

1.2 試劑與藥品 甲醇（色譜純，Tedia）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific）；水（超純水）；甲酸（色譜純，Sigma－Aldrich）；富馬酸美托洛爾緩釋片（山東齊都藥業(yè)有限公司，95 mg／片，批號(hào)：111001）；琥珀酸美托洛爾緩釋片（阿斯利康制藥有限公司，95 mg／片，批號(hào)：ML5588）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康比格犬12只（雌雄各半），普通級，6.1～6.6 kg，年齡為7～9月，濟(jì)南立秋實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心，許可證號(hào)：SCXK（魯）20070024。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

2 方法和結(jié)果

2.1 試驗(yàn)方案及血樣采集

2.1.1 單次給藥方案 將檢疫飼養(yǎng)兩周的6只健康普通級比格犬隨機(jī)分成兩組，交叉灌胃供試品片（1～3號(hào)犬）和對照品片（4～6號(hào)犬）各95 mg；試驗(yàn)前比格犬禁食12 h，給藥4 h后統(tǒng)一進(jìn)食。第1次樣品采集結(jié)束2周后，兩組自身交叉給藥。給藥前（0 h）及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、10、14、18、24、30、36和48 h共15個(gè)時(shí)間點(diǎn)，靜脈采血約2.0 mL，置抗凝（肝素）采血管中，立即3 000 rmp離心（30 min內(nèi)）取血漿，－50℃冷凍保存。

2.1.2 多次給藥方案 單次給藥結(jié)束3周后，與另外6只健康普通級比格犬隨機(jī)分成兩組，分為富馬酸美托洛爾多次給藥組，琥珀酸美托洛爾多次給藥組，每組雌雄各半（1～3號(hào)比格犬為雄性，4～6號(hào)為雌性）。多次給藥組連續(xù)給藥7 d，于給藥第4天、第5天、第6天前，第7天給藥前（0 h）及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、10、14、18、24、30、36和48 h共15個(gè)時(shí)間點(diǎn)，靜脈采血約2.0 mL，置抗凝（肝素）采血管中，立即3 000 rmp離心（30 min內(nèi)）取血漿，－50℃冷凍保存。

2.2 血漿樣品測定

2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相：乙腈－水（0.1%甲酸）＝40∶60；流速：0.3 mL·min－1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：3μL；Zorbax RX－C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，5μm）；Zorbax SB－C8預(yù)柱（2.1 mm×12.5 mm，5μm）；采樣時(shí)間3 min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源，離子源溫度：350℃；干燥氣流速：10.0 L·min－1；霧化氣壓力：40.0 psi；美托洛爾檢測離子：268.2→116.2，普萘洛爾檢測離子：260.2→116.2；碎片均為135；碰撞能量：美托洛爾為20，普萘洛爾為22。

2.2.3 血漿樣品預(yù)處理 精密量取血漿0.5 mL，加入50μL普萘洛爾內(nèi)標(biāo)溶液（23.667 ng·mL－1），加入0.5 mL氫氧化鈉溶液（1 mol·L－1），渦旋約10 s，加入正己烷－二氯甲烷（4∶1）混合溶液4 mL，渦旋震蕩提取約1 min，離心10 min（3 000 rmp），吸取上層有機(jī)相3 mL，在37℃水浴中以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00μL甲醇溶解后，加入流動(dòng)相100μL，渦旋約10 s，取上清液于棕色進(jìn)樣瓶中，自動(dòng)進(jìn)樣3 μL分析。

2.3 分析方法的驗(yàn)證

2.3.1 專屬性 分別取6只犬的空白血漿0.5 mL，不加內(nèi)標(biāo)按“2.2.3”樣品處理方法進(jìn)行處理，得空白血漿色譜圖；將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加至空白血漿中，依同法操作，得血漿外加標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)色譜圖；犬給藥后血漿樣品，依同法操作，得血漿樣品色譜圖。結(jié)果表明，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾美托洛爾及普萘洛爾的測定，血漿的空白色譜圖、血漿外加標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)色譜圖、血漿樣品色譜圖譜圖參見圖1，美托洛爾及普萘洛爾的保留時(shí)間分別為1.33 min及1.61 min。本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測定血漿中美托洛爾的濃度，靈敏度較高。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 取犬空白血漿0.45 mL，加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液得空白血漿中美托洛爾的濃度分別為0.045、0.179、1.436、2.872、5.743、11.486、22.972和45.944 ng·mL－1，加入23.667 ng·mL－1普萘洛爾內(nèi)標(biāo)溶液50μL，按“2.2.3”所述的方法進(jìn)行處理后分析。以美托洛爾與普萘洛爾濃度的比值為橫坐標(biāo)，美托洛爾與普萘洛爾檢出信號(hào)比值縱坐標(biāo)作圖，并進(jìn)行回歸運(yùn)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A＝1.435 6C＋0.061 0，R2＝0.999 7，在0.045～45 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 美托洛爾（A）及普萘洛爾（B）在犬血漿中的色譜圖（從左至右依次為血漿空白、血漿外加美托洛爾及普萘洛爾、血漿樣品）

2.3.3 提取回收率 取犬空白血漿0.45 mL，分別加入0.897、114.859、367.55 ng·mL－1的美托洛爾50μL，使得空白血漿中美托洛爾的濃度為0.089 7，11.486，36.755 ng·mL－1，加入23.667 ng·mL－1普萘洛爾內(nèi)標(biāo)溶液50μL，按“2.2.3”所述的方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣分析。另取犬空白血漿0.5 mL，按“2.2.3”所述的方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣分析。

結(jié)果表明，本法測定犬空白血漿中0.089 7、11.486、36.755 ng·mL－1濃度藥物的回收率在80%～94%。

2.3.4 精密度 取犬空白血漿0.45 mL，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法配制美托洛爾低、中、高不同濃度的血漿樣品，按“2.2.3”所述的方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣分析。每個(gè)濃度5個(gè)樣本，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品的測定濃度，根據(jù)QC樣品結(jié)果計(jì)算精密度。

結(jié)果表明，日內(nèi)精密度最大為5.09%；日間精密度最大為5.15%，均小于15%。

2.3.5 定量限和檢測限 在選定的色譜條件下，取不同濃度的美托洛爾對照溶液進(jìn)樣，按實(shí)驗(yàn)所用色譜條件以信噪比（S／N）3∶1記為檢測限，以信噪比（S／N）10∶1記為定量限。最終實(shí)驗(yàn)測定美托洛爾的定量限為0.044 9 ng·mL－1，檢測限為0.013 7 ng ·mL－1。

2.4 血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 以空白血漿樣品配制美托洛爾濃度分別為0.897、114.859、367.55 ng·mL－1的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別于室溫下放置3 h，按“2.2.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法提取，評價(jià)短期室溫放置條件下樣品的穩(wěn)定性；于冰箱－20℃貯存4 h取出室溫解凍，按同法處理，然后再把樣品放回冰箱－20℃貯存4 h，然后再解凍提取，評價(jià)凍融穩(wěn)定性（共2次）；于冰箱－20℃貯存，于第0、2、7天取出室溫解凍，按“2.2”項(xiàng)下血漿樣品處理方法，評價(jià)凍存穩(wěn)定性。

結(jié)果表明美血漿樣品室溫放3 h，凍融2次，凍存7 d均較穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)差均小于15%。

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 比格犬單次和多次灌胃富馬酸美托洛爾緩釋片與琥珀酸美托洛爾緩釋片后平均藥－時(shí)曲線分別見圖2和圖3。

圖2 比格犬單次灌胃富馬酸美托洛爾緩釋片與琥珀酸美托洛爾緩釋片后平均藥－時(shí)曲線（每只95 mg·d－1，n＝6，雌雄各半）

采用Excel軟件計(jì)算血漿藥物濃度均值，標(biāo)準(zhǔn)差（SD或S），相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），相對偏差（RE）；

采用DAS 2.0程序統(tǒng)計(jì)矩方法求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，計(jì)算生物等效性，結(jié)果見表1。

圖3 比格犬多次灌胃富馬酸美托洛爾緩釋片與琥珀酸美托洛爾緩釋片后平均藥－時(shí)曲線（每只95 mg·d－1，n＝6，雌雄各半）

將所得到的主要的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，結(jié)果表明兩種制劑單次給藥和多次給藥，以及兩種藥物單次給藥和多次給藥的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間AUC和MRT之間均無限制性差異（P＞0.05），這提示富馬酸緩釋片具有一定的緩釋特性。

表1 比格犬單次、多次灌胃每只給予95 mg·d－1富馬酸美托洛爾緩釋片及琥珀酸美托洛爾緩釋片的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）

表1 比格犬單次、多次灌胃每只給予95 mg·d－1富馬酸美托洛爾緩釋片及琥珀酸美托洛爾緩釋片的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）

注：T藥與R藥單次各參數(shù)相比，T藥與R藥多次給藥各參數(shù)相比，T藥單次與多次各參數(shù)相比，R藥單次與多次相比各參數(shù)無顯著差異（P＞0.05）

富馬酸美托洛爾緩釋片 琥珀酸美托洛爾緩釋片參數(shù) 單位2.828±0.373單次給藥 多次給藥921.807±209.894 AUC0～t μg·L－1·h 879.465±82.962 928.721±101.554 896.840±201.283 949.140±213.752 AUC0～∞ μg·L－1·h 882.805±81.024 932.677±102.268 897.943±201.791 951.061±213.038 MRT0～t h 8.332±0.937 7.694±0.937 8.183±1.661 7.929±0.608 MRT0～∞ h 8.532±1.106 7.910±0.986 8.236±1.709 8.042±0.612 t1／2z h 6.864±1.622 7.045±1.815 4.473±0.742 6.123±3.316 Tmax h 3.500±0.548 3.167±0.983 3.167±0.408 3.500±1.517 CLz L·h－1 108.430±10.728 102.916±11.635 110.372±24.937 104.115±23.207 Vz L 1 080.431±301.333 1 060.525±386.703 711.973±182.822 957.127±616.998 Cmax μg·L－1 101.324±21.990 104.684±23.852 98.363±15.828 115.024±22.479 DF —— —— 2.800±0.725 ——單次給藥 多次給藥AUCss μg·L－1·h —— 890.955±89.284 ——

3 討論

3.1 關(guān)于血藥濃度測定方法 本試驗(yàn)采用液液萃取法提取比格犬血漿中美托洛爾，LC－MS／MS法測定血藥濃度，目前國內(nèi)尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。方法學(xué)考察結(jié)果表明，此方法簡單快速，靈敏準(zhǔn)確，能適用于測定富馬酸美托洛爾緩釋片和琥珀酸美托洛爾緩釋片在比格犬血漿中的血藥濃度。

3.2 關(guān)于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 經(jīng)配對t檢驗(yàn)，單次灌胃給藥參比制劑R藥和試驗(yàn)制劑T藥的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC0～t、Cmax無明顯差異（P＞0.05）。兩種制劑的對數(shù)值按多因素方差分析結(jié)果表明，AUC0～t、Cmax制劑間、周期間和個(gè)體間均無差異（P＞0.05）。以AUC0～t對數(shù)值采用雙向單側(cè)t檢驗(yàn)，計(jì)算出90%置信區(qū)間為83.5%～119.2%，在此區(qū)間內(nèi)，同時(shí)求得tH＝2.698，tL＝2.640；Cmax對數(shù)值采用雙向單側(cè)t檢驗(yàn)，計(jì)算出90%置信區(qū)間為92.5%～112.5%，在此區(qū)間內(nèi)，求得tH＝5.786，tL＝6.697；對Tmax真值采用配對Wilcoxon法檢驗(yàn)，可知，兩制劑Tmax無差異；提示相對生物利用度為101.2%±18.8%，富馬酸美托洛爾緩釋片（T藥）與琥珀酸美托洛爾緩釋片（R藥）比格犬單次灌胃給藥后生物等效。

多次灌胃給藥后，T藥與R藥達(dá)峰時(shí)間Tmax相近（3.167 h vs 3.500 h，P＞0.05），C相近（104.684μg·L－1vs 115.024μg·L－1，P＞0.05），T藥t1／2z與R藥相近（7.045 h vs 6.123 h，P＞0.05），平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度Cav相近（37.123 vs 38.720，P＞0.05）。多次灌胃T藥及R藥，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC、Cmax、Tmax、t1／2z之間無顯著性差異；6只比格犬的血藥濃度均呈穩(wěn)態(tài)。

4 結(jié)論

本研究表明，富馬酸美托洛爾緩釋片具有顯著的緩釋特征，在有效防治高血壓等疾病的同時(shí)，明顯降低藥物在循環(huán)系統(tǒng)中的血藥濃度峰值，減小了血藥濃度的波動(dòng)，在體內(nèi)無蓄積作用，有望減少了藥物的不良反應(yīng)，有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值，期望能夠?yàn)樵撝苿┑拈_發(fā)提供依據(jù)。

［1］陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學(xué)［M］.第15版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：238.

［2］L?benberg R，Kim JS，Amidon GL.Pharmacok inetics of an immediate release，a controlled release and a two pulse dosage form in dogs［J］.Eur J Pharm Biopharm，2005，60（1）：17－23. ［3］董淼偉.時(shí)辰藥理學(xué)與老年高血壓的合理用藥［J］.中國老年學(xué)雜志，2008，28（22）：2287－2288.

［4］匡玉霞，付曉琴，劉生友.高血壓病的最佳給藥時(shí)間探討［J］.中國藥師，2008，11（9）：1113－1114.

［5］王美芳.常用藥物的最佳給藥時(shí)間［J］.中外健康文摘（臨床醫(yī)師），2008，8：155.

［6］劉弢，謝英，周玉杰，等.琥珀酸美托洛爾緩釋片治療輕中度原發(fā)性高血壓的臨床研究［J］.中國心血管雜志，2007，12（4）：287－289.

［7］黃桂華，張娜，高彥慧，等.琥珀酸美托洛爾緩釋片狗體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2004，42（1）：56－59.

Pharmacokinetics of different Metoprolol Fumarate Sustained－release Tablets in beagle dogs

LI Hou-tao1，3，LI Bao-qiu1，HUANG Gui-hua1，REN Wen-gang3，GAO Xi-bo3，F(xiàn)ANG Shi-hong2
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Shandong Hongli Medical Animal Experimental Research Co.，Ltd.，Jinan 250012，China；3.Shandong Qidu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Zibo 255000，China）

ObjectiveTo investigate the pharmacokinetics and the sustained－released characteristics of Metoprolol Fumarate Sustained－release Tablets in beagle dogs.MethodsTwelve beagle dogs were given single dose and multiple dose of fumarate sustained－release tablets and succinate metoprolol sustained－release tablets according to the randomized cross－cover design.The metoprolol concentration in plasma was determined by the LC－MS／MS method.The main pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.0 software and the statistical analysis was performed by the excel program.ResultsThe statistical analysis showed that the AUC，t1／2，Tmaxand Cmaxwere no significantly different between the sustained－release tablets of metoprolol fumarate and succinate metoprolol.ConclusionMetoprolol Fumarate Sustainedrelease Tablets possessed excellent sustained release performance.

Metoprolol fumarate；Sustained－release tablets；LC－MS／MS；Pharmacokinetic

R969.1

A

2095－5375（2014）01－0005－005

李后濤，男，研究方向：藥劑學(xué)，E－mail：lihoutao456＠163.com