參芪扶正注射液對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用※

蔡英敏 胡海濤 馬小亞 宋金鑫 王美納

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科，西安710004）

參芪扶正注射液對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用※

蔡英敏 胡海濤 馬小亞 宋金鑫 王美納

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科，西安710004）

目的研究參芪扶正注射液對(duì)老齡大鼠腦缺血損傷后的保護(hù)作用。方法老年雄性SD大鼠，體重200～300g，隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、陽(yáng)性對(duì)照組和參芪扶正注射液組。用大腦中動(dòng)脈線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，參芪扶正注射液在缺血前一周靜脈給藥，觀察缺血3h再灌3h后對(duì)大鼠神經(jīng)功能障礙、腦梗塞范圍、血清乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK）活性、腦組織鈣、水、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量。結(jié)果實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參芪組大鼠能明顯改善神經(jīng)功能缺陷，減少腦組織含水量，縮小腦梗塞范圍，抑制Ca2＋聚集，血清中乳酸脫氫酶、肌酸激酶及腦組織中丙二醛含量明顯低于模型組，腦組織中超氧化物歧化酶活性明顯高于模型組。結(jié)論參芪扶正注射液對(duì)老齡大鼠腦缺血損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除氧自由基抑制腦組織Ca2＋聚集有關(guān)。

參芪扶正注射液；腦缺血；氧自由基；中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)

隨著中國(guó)人口逐漸老齡化，許多老年性疾病，如老年性癡呆、腦中風(fēng)等越來(lái)越受到人們的關(guān)注，但截止目前此類(lèi)疾病仍沒(méi)有一種十分有效的治療方法。參芪扶正注射液是傳統(tǒng)扶正補(bǔ)益中藥黃芪、黨參提取物，它的研究大多集中在提高腫瘤患者免疫力方面，而對(duì)于腦缺血及其后遺癥治療方面的報(bào)道較少。本研究采用改良Longa［1］法制成大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，從功能、組織學(xué)、生物化學(xué)角度觀察參芪扶正注射液對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注損傷后的保護(hù)作用，并初步探討它的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物20～22月齡，SD老年大鼠，體重200～300g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要儀器與藥品雙極電凝購(gòu)自上海醫(yī)療器械六廠，氯胺酮由上海第一制藥廠提供，參芪扶正注射液由麗株利民制藥廠提供，尼莫地平購(gòu)自天津氨基酸公司。

1.3動(dòng)物模型采用改良Longa法，大鼠腹腔注射氯胺酮100mg·kg－1麻醉。將大鼠仰臥定于臺(tái)板上，頸部正中切口，顯微鏡下分離左頸總動(dòng)脈（CCA）及其分叉處，游離頸外動(dòng)脈（ECA），并電凝切斷ECA發(fā)出的動(dòng)脈分支。再向頭端游離ECA，用5－0絲線結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端，在靠近遠(yuǎn)端結(jié)扎線處剪斷ECA，取一根長(zhǎng)5cm的4～0單絲尼龍線，頭端加熱成鼓錘狀，置入ECA中，用絲線扎緊以免出血，將尼龍絲由ECA緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），調(diào)整方向?qū)⑺ㄈ€插進(jìn)顱腔，感到阻力時(shí)即達(dá)大腦前動(dòng)脈（ACA），從ICA起始處算起，插入深度一般為20～21mm，此時(shí)大腦中動(dòng)脈（MCA）起始處阻斷，同時(shí)也阻斷了來(lái)自ICA、ACA、PCA的側(cè)副血流，導(dǎo)致MCA區(qū)局部缺血。然后扎緊ECA殘端絲線以免滑脫，縫合切口，引出尼龍線于皮膚切口處，回籠飼養(yǎng)。缺血3h后，在無(wú)麻醉狀態(tài)下輕輕拔出尼龍線恢復(fù)血流，拔線時(shí)感到阻力即停止，絲線頭端已退回到ECA殘端內(nèi)，此時(shí)制成缺血再灌注模型。再灌3h后，按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行觀察取樣。假手術(shù)組僅將尼龍線放入ECA，不進(jìn)入ICA，其它操作相同。手術(shù)過(guò)程觀察呼吸節(jié)律，用加熱燈保持大鼠體溫37± 0.5℃（肛溫），應(yīng)無(wú)出血、無(wú)呼吸困難，動(dòng)脈色澤正常。

1.4實(shí)驗(yàn)分組模型組和假手術(shù)組：尾靜脈注入生理鹽水一周；尼莫地平陽(yáng)性對(duì)照組：尾靜脈注入尼莫地平1 mg／kg一周；參芪組：尾靜脈注入?yún)④畏稣⑸湟?0ml／kg一周（按照大鼠每公斤體重藥量是人類(lèi)的10倍進(jìn)行換算，每250ml中含黨參、黃芪各10g）。

1.5神經(jīng)癥狀的觀察參考Longa的方法在缺血3h再灌3h末進(jìn)行5分制評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無(wú)明顯神經(jīng)缺損癥狀；1分：不能完全伸展前爪；2分：行走時(shí)，身體向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)向右側(cè)傾倒；4分：不能自行行走，意識(shí)消失。

1.6腦梗塞范圍的測(cè)定評(píng)分后大鼠斷頭取全腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，用雙面刀片將大腦沿冠狀面切成厚度基本相同的6片，放入1%TTC染色液中，37℃水浴中溫育30min，正常組織呈紅色，梗塞組織呈白色。再將腦片置10%甲醛中固定，仔細(xì)分離出梗塞區(qū)腦組織，并稱取梗塞腦組織及全腦重量，以梗塞組織重量占全腦重量的百分比作為梗塞范圍。并按下式計(jì)算給藥組腦梗塞范圍的抑制率：

抑制率（%）＝（1－給藥組梗塞范圍／缺血再灌注組梗塞范圍）×100%

1.7腦組織含水量及Ca2＋的測(cè)定按Gotoh等［2］方法，于缺血3h再灌3h末快速剝?nèi)∈竽X，切取梗塞側(cè)半球前半部分的腦組織稱其濕重，再置于105℃烤箱中烘烤48 h，稱干重。按下式計(jì)算腦組織含水量：

腦含水量（%）＝（濕重－干重）／濕重×100%

用濃硫酸消化法消化腦組織干樣，加1%LaO－0.5mol·L－1HCL去離子水溶液定容，原子吸收光譜法測(cè)定腦組織Ca2＋含量。

1.8血清乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK）測(cè)定

再灌6h后，眼眶取血，分離血清，用比色法在λ440nm處測(cè)定LDH活性，單位定義：以100ml血清中在37℃與基質(zhì)作用15min，能生成1μmol丙酮酸即為一個(gè)LDH活力單位。用肌酸顯色法在λ520nm處測(cè)定CK，單位定義：每升血清在37℃與基質(zhì)作用，每分鐘產(chǎn)生1μmol肌酸稱為一個(gè)CK活力單位。

1.9大鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量測(cè)定取上述梗塞側(cè)半球后半部分腦組織，用冰冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙拭干后稱重，量取腦組織重量9倍體積的冰冷生理鹽水，在內(nèi)切式勻漿器上制成100g·L－1的勻漿。離心20min（1500r·min－1），取上清液用TBA反應(yīng)比色法在λ532nm處測(cè)定MDA含量，結(jié)果以nmol·g－1protein表示。用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性，420nm控制鄰苯三酚自氧化速率為0.03OD／分，單位定義在：1ml反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量為一個(gè)活力單位，結(jié)果以U·mg－1qrotein表示。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定腦勻漿蛋白質(zhì)含量（mg·ml－1）。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，組間差異比較計(jì)量?資料用F分析和t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用四格表確切概率法檢驗(yàn)，P＜0．05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1參芪扶正注射液對(duì)大鼠行為缺陷程度的影響缺血再灌注組所有大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，主要表現(xiàn)為右前肢內(nèi)收，肩內(nèi)旋，提尾懸空時(shí)，右前肢緊貼胸壁。參芪組能顯著改善大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙，其行為評(píng)分與缺血再灌注對(duì)照組比較差異具有非常顯著意義（P＜0.01）結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 參芪扶正注射液對(duì)大鼠行為缺陷程度的影響

表1 參芪扶正注射液對(duì)大鼠行為缺陷程度的影響

注：**P＜0．01與缺血再灌注組比較

分組劑量（mg·kg－1）神經(jīng)功能評(píng)分（分）假手術(shù)組－0缺血再灌組－2．13＋0．38參芪組1．6 0．85＋0．32**尼莫地平組0．5 0．60＋0．52**

2.2參芪扶正注射液對(duì)腦梗塞范圍的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 參芪扶正注射液對(duì)腦梗塞范圍的影響

表2 參芪扶正注射液對(duì)腦梗塞范圍的影響

－1分組劑量（mg·kg）梗塞范圍（%）抑制率（%）缺血再灌組19．72＋3．88參芪組1．6 12．22＋4．63**31．8尼莫地平組0．5 9．27＋4．36**－48．3

由表2可見(jiàn)，與缺血再灌組相比，參芪組可顯著縮小腦梗塞范圍（P＜0.01）。

2.3參芪扶正注射液對(duì)腦組織含水量的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 參芪扶正注射液對(duì)腦組織含水量的影響（x±s，n＝10）

由表2可見(jiàn)，缺血再灌組腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），與缺血再灌組相比，參芪扶正注射液能明顯減少再灌組腦組織含水量。

2.4參芪扶正注射液對(duì)腦組織Ca2＋含量的影響結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 參芪扶正注射液對(duì)腦組織Ca2＋含量的影響（x±s，n＝10）

由表4可見(jiàn)，缺血再灌組腦組織Ca2＋含量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），參芪扶正注射液能明顯減少腦組織Ca2＋含量。

2．5參芪扶正注射液對(duì)血清LDH和K的影響見(jiàn)表5。

表5 參芪扶正注射液對(duì)血清LDH和CK的影響（x±s）

與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組外周血LDH和CK活力顯著增高（P＜0.01）。參芪扶正注射液可明顯抑制血清中LDH和CK活性增長(zhǎng)。

2．6參芪扶正注射液對(duì)腦組織中SOD活性和MDA含量的影響見(jiàn)表6。

表6 參芪扶正注射液對(duì)腦SOD活性和MDA含量的影響

表6 參芪扶正注射液對(duì)腦SOD活性和MDA含量的影響

注：△P＜0.01，與假手術(shù)組比較；*P＜0.05，**P＜0.01與缺血再灌注組比較

12缺血再灌組－0．78＋0．21△120．21＋45．16△參芪組1．6 1．39＋0．72*60．41＋13．81*尼莫地平組1 1．49＋0．16**86．12＋46．01 rotein假手術(shù)組－1．78＋0．84 76．01＋29．分組劑量／mg·kg－1SOD／U·mg－1protein MDA／nmol·g－1p *

與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組腦內(nèi)SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增高（P＜0.01），參芪扶正注射液可明顯增加腦內(nèi)SOD活性，抑制MDA含量（P＜0.05）。

3 討論

腦缺血損傷可以誘發(fā)癡呆［3］。由于血流障礙，引起慢性腦組織缺血，使皮質(zhì)細(xì)胞減少，大量的神經(jīng)元纖維變性退化，神經(jīng)細(xì)胞退行性病變，大腦半球的白質(zhì)發(fā)生彌漫性脫髓鞘病變，最終使大腦功能全面衰退。

建立重復(fù)性好、敏感性高、梗塞部位恒定的活體腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ褪茄芯咳毖阅X血管病的病理生理變化和評(píng)價(jià)藥物對(duì)缺血性腦血管疾病的防治效果的重要前提。大鼠具有與人類(lèi)相似的腦血管解剖結(jié)構(gòu)和功能、種系內(nèi)純合性好、價(jià)廉易得等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用作腦缺血的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。局部腦缺血模型一般采用大腦中動(dòng)脈阻斷法，該法是目前最為普遍接受的篩選和評(píng)價(jià)藥物抗腦缺血作用的模型之一。本文采用可逆性大腦中動(dòng)脈線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。較好模擬了人類(lèi)缺血性腦病的永久性及暫時(shí)性局灶性腦缺血的各種狀態(tài)，對(duì)評(píng)價(jià)再灌注的作用及藥物療效更有說(shuō)服力。

氯化三苯基四氮唑（TTC）組化染色技術(shù)是一種確定梗塞范圍的常用方法，本研究所制作的大鼠缺血再灌注模型為缺血3h，再灌注3h，用TTC染色所測(cè)定的梗塞范圍為（19.72＋3.88）%，而參芪組的梗塞范圍為（12.22＋4.63）%。與缺血再灌注組比較，參芪可顯著縮小梗塞范圍（P＜0.01），以縮小梗塞灶周?chē)鷧^(qū)即額頂皮層邊緣部為主。說(shuō)明參芪扶正注射液對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。

腦水腫是腦缺血不可避免的后果，它明顯影響死亡率和致殘率。由于缺血缺氧，腦細(xì)胞能量代謝紊亂，胞內(nèi)Na＋、水潴留，細(xì)胞膜損害，胞內(nèi)液體異常增加；同時(shí)缺氧后大量自由基的產(chǎn)生，誘發(fā)腦血管上皮的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，引起血腦屏障破壞，通透性增加，血漿成分漏入細(xì)胞外間隔，引發(fā)腦水腫。［4］結(jié)果顯示參芪組能明顯減少梗塞側(cè)腦組織的腫脹程度，減少患側(cè)腦組織含水量。說(shuō)明參芪扶正注射液對(duì)上述病理過(guò)程有抑制作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，患者臟腑氣虛，髓海不足，氣血失和，氣機(jī)升降失調(diào)，水津失于運(yùn)化，疾濁瘀血交結(jié)。其基本病位在腦，其本在于心、脾、肝、腎的功能失調(diào)，其標(biāo)在于瘀血痰濁蒙蔽清竅，而致神機(jī)失統(tǒng)，其病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，氣虛血瘀是缺血性損傷發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)。［5］參芪扶正注射液是選用黃芪、黨參為原料制成的中藥注射液，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益氣扶正、補(bǔ)脾益腎之功效。其中黨參具有健脾益氣，生津養(yǎng)血的作用，中醫(yī)認(rèn)為脾為后天之本，氣血生化之源，生氣化血可達(dá)到養(yǎng)心安神之效，神志安則智慧增。研究發(fā)現(xiàn)黨參對(duì)小鼠的記憶作用有非常大的影響。而黃芪則為補(bǔ)氣藥之長(zhǎng)，有健脾益氣，補(bǔ)氣還陽(yáng)之效，補(bǔ)力較強(qiáng)，補(bǔ)氣作用全面。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黨參和黃芪均具有擴(kuò)血管，降血壓，增加人體免疫的功效，同時(shí)還具有激活和恢復(fù)紅細(xì)胞變形能力，改善微循環(huán)的作用。黨參和黃芪合用，可明顯增強(qiáng)黨參健脾的功能，由于脾為氣血生化之源，脾健則氣血充，從而腦健神明［6］。

腦缺血再灌注損傷時(shí)，由于缺血、缺氧導(dǎo)致乳酸酸中毒，細(xì)胞膜及毛細(xì)血管通透性增加，甚至膜損傷，大量蛋白酶外釋。細(xì)胞內(nèi)LDH和腦型肌酸激酶釋放至細(xì)胞外液，進(jìn)入腦脊液和血液，導(dǎo)致腦組織LDH和CK活性降低，血清中酶的活性增高，并且血清LDH、CK活性增高程度與損傷范圍及損傷程度相一致。氧自由基的生成及其引起的脂質(zhì)過(guò)氧化是缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。腦缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，大量游離脂肪酸及興奮性氨基酸增加，激活自由基連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基。丙二醛是自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量的變化可間接反映組織中氧自由基的變化。［7］結(jié)果表明，腦缺血3h，再灌注3h時(shí)，腦組織SOD活性明顯下降，MDA含量明顯增加，間接證實(shí)缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化物。參芪扶正注射液缺氧前給藥可提高腦組織SOD活性，有利于清除自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，使MDA含量減少。這與文獻(xiàn)報(bào)道黃芪可提高SOD活性，從而減輕自由基造成的損傷［8］的結(jié)果是一致的。

綜上所述，自由基損傷在急性腦血管病，尤其是腦缺血中起到致關(guān)重要的作用，因此研究和應(yīng)用有效的清除自由基的藥物，是腦保護(hù)的重要環(huán)節(jié)之一［9］，參芪扶正注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制腦組織Ca2＋聚集及抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。為其在腦血管方面的用途開(kāi)辟一條新的途徑。對(duì)其作用和臨床實(shí)驗(yàn)還有待于進(jìn)一步的研究。

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The Pr ot ec tiv e Ef f ec ts o f Senqi Fuz heng Inje c tion Against Is c hemia-r e p er f usion Inju r y in Ol d Rat Br ain s

Cai Yingmin Hu Haitao M a Xiaoya Song Jinxin Wang M eina
（The anesthesiology department of the second affiliated hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an，710004，China）

ObjectiveTo study the protective effects of Senqi Fuzheng Injection against ischemia－reperfusion injury in old rat brains．MethodsHealthy and old SD male mice，weight 200～300g，they were divided randomly into 4 groups：model group，control group，nimodipine group and Senqi Fuzheng Injection group．There were 10 in each group．Modified Longa model of focal cerebral ischemia-reperfusion injury was used．Senqi Fuzheng Injection was administered I．P．one week before ischemia，Nervous function，brain infarction area，serum lactate dehydrogenase（LDH）and creatine kinase（CK）levels，brain Ca2＋，water，MDA and SOD levels were observed after 3h ischemia and 3h reperfusion．ResultsSenqi Fuzheng Injection could improve nervous of rats，decreased water content of brain，decreased the infarction area of brain，inhibited Ca2＋，LDH、CK levels in serum and MDA in brain were lower in Senqi Fuzheng Injection group than in model group，SOD activity in Senqi Fuzheng Injection group was higher than in model group．ConclusionSenqi Fuzheng Injection has protective effect against cerebral ischemia－reperfusion injury in old rats．Inhibition of lipid peroxidation and Ca2＋may be the mechanism．

Senqi Fuzheng Injection；Brain ischemia；Lipid peroxidation；Traditional Chinese medicine experiment

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.07.103

：1672-2779（2014）-07-0147-03

蘇 玲 本文校對(duì)：張蓬勃

2013-12-21）

國(guó)家自然科學(xué)基金［No：30070731］；國(guó)家重點(diǎn)臨床專(zhuān)科建設(shè)單位項(xiàng)目；陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目［No：2003K10-G86］