梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)展與評(píng)價(jià)

曾雪梅

廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣西南寧市 530021

梅毒是由梅毒蒼白螺旋體（Treponema pallidum，TP）感染而引起的一種性傳播疾病，常累及生殖器官、附屬淋巴結(jié)等，并能引起全身性病變的慢性傳染病。近年來，由于梅毒感染率增加十分迅速，梅毒已成為國際社會(huì)共同關(guān)注的一個(gè)社會(huì)性問題［1］。梅毒與艾滋病有著共同的傳播途徑，因此梅毒的防治，對(duì)艾滋病的防控有著重要的意義。由于至今尚未建立梅毒螺旋體的體外培養(yǎng)方法，實(shí)驗(yàn)室主要從病原學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)方面進(jìn)行檢測(cè)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，近年來，快速靈敏、準(zhǔn)確性及特異性均高的梅毒診斷技術(shù)得到不斷地更新完善，現(xiàn)綜述如下。

1 梅毒螺旋體病原學(xué)檢查

1.1 暗視野顯微鏡檢查和活檢 多用于起病初期，在病灶中采集分泌物后立即做暗視野顯微鏡觀察，可以直接鏡檢到梅毒螺旋體（TP），對(duì)Ⅰ、Ⅱ期梅毒診斷具有重要價(jià)值，具有簡(jiǎn)便、快速、易于操作的特點(diǎn)。但該方法多受檢驗(yàn)人員技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)等外部因素的影響，且不能區(qū)分梅毒螺旋體及其他類似梅毒螺旋體的物質(zhì)，敏感性與特異性較低。梅毒螺旋體只能在活體內(nèi)繁殖，不能在體外培養(yǎng)，主要對(duì)眼前房和兔睪丸敏感。但因操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)效和成本等原因，除研究外一般不做兔睪丸感染試驗(yàn)。

1.2 多功能顯微診斷儀（MDI）［2］是近年來，由國外開發(fā)的一種暗視野、偏振光及綜合相差對(duì)比的可變投影顯微鏡。該儀器集合了醫(yī)學(xué)影像學(xué)、光電學(xué)、電子學(xué)和計(jì)算機(jī)等技術(shù)于一身。標(biāo)本不需要任何加工處理即可直接進(jìn)行觀察，其優(yōu)點(diǎn)在于分辨率高（最高可達(dá)0.2μm）、放大倍數(shù)高、清晰度高等。主要用于一期梅毒的診斷，具有準(zhǔn)確方便、快速直接的特點(diǎn)［3］，其缺點(diǎn)為設(shè)備昂貴，該方法在臨床上還未廣泛推廣應(yīng)用。

2 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

由于梅毒自然病程存在潛伏期，血清學(xué)診斷是梅毒診斷（特別是潛伏期和晚期梅毒診斷）的重要手段。選擇特異性、敏感性均高的血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)梅毒的預(yù)防和診療都十分重要，梅毒血清學(xué)檢測(cè)分為非特異性抗體及特異性抗體檢測(cè)兩大類。

2.1 梅毒螺旋體非特異性抗體檢測(cè)技術(shù) 非特異性抗體檢測(cè)方法名稱很多，包括不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)（USR）、性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL）、梅毒甲基胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）、快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）等。這些方法的原理基本相同，主要是梅毒螺旋體進(jìn)入人體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗心磷脂抗體（即反應(yīng)素），試驗(yàn)采用的抗原為卵磷脂、心磷脂與膽固醇的混合物，抗原－抗體以一定比例相互作用時(shí)出現(xiàn)凝集反應(yīng)。主要差異是吸附抗心磷脂類抗原的物質(zhì)不同，為了便于肉眼觀察到陽性的凝集現(xiàn)象，常把抗原結(jié)合到有色物質(zhì)上，如TRUST用甲基胺紅，凝集顆粒呈紅色，RPR試驗(yàn)用活性炭，凝集顆粒呈黑色等。這些試驗(yàn)簡(jiǎn)單快速、試劑成本低，適宜基層和人群篩查，是國內(nèi)目前普遍使用的方法，其中最常用TRUST。它們均可做定性和半定量，主要是根據(jù)滴度數(shù)值判斷梅毒的療效、復(fù)發(fā)或再感染［4］。梅毒滴度是判斷梅毒治療及療效轉(zhuǎn)歸的重要指標(biāo)之一［5］。同時(shí)感染梅毒后，患者血清中產(chǎn)生抗類脂抗原抗體，多在梅毒感染3～4周后，在此之前檢測(cè)可能出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，非特異性抗體實(shí)驗(yàn)特異性不高。在很多疾病過程如瘧疾、結(jié)核和麻風(fēng)等，機(jī)體可能會(huì)產(chǎn)生抗類脂抗原抗體，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。此外，懷孕、腫瘤、吸毒和結(jié)締組織疾病等都有可能造成非梅毒螺旋體抗體檢查的假陽性［6］。故應(yīng)同時(shí)結(jié)合其他梅毒螺旋體特異性抗體試驗(yàn)。

2.2 梅毒螺旋體特異性抗體檢測(cè)技術(shù) 其原理是隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用梅毒螺旋體或其成分作抗原，檢測(cè)患者血清中的梅毒螺旋體抗體，該檢測(cè)技術(shù)特異性和敏感性均較高，為梅毒確診實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)（TPHA）。將特異性TP抗原致敏羊紅細(xì)胞，這類紅細(xì)胞與患者血清中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中使用血清吸收劑，去除了各種非特異性抗體的干擾，提高了TPHA的敏感性和特異性。但試劑成本較高，易自凝，不適用批量檢測(cè)，常用作梅毒的確認(rèn)試驗(yàn)［7］。

2.2.2 梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）。與TPHA原理基本相同，主要的區(qū)別在于特異性TP抗原致敏的是明膠顆粒，試劑制備過程中不存在非特異抗原的干擾，并能測(cè)定抗體的效價(jià)，具有高敏感性和特異性，一般用于梅毒的確證。但該類方法檢測(cè)的是梅毒螺旋體混合抗體IgM和IgG，患者血清中IgG抗體可終身陽性。因此不能僅憑TP抗體陽性而診斷為梅毒，梅毒的診斷應(yīng)以癥狀、體征、病史以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析［8］。

2.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。為雙抗原夾心法，其原理是將高純度的特異性TP抗原包被微板，測(cè)血清中梅毒螺旋體抗體。目前已有多種商品化試劑盒，在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用［9，10］。ELISA法簡(jiǎn)便快捷，影響因素較少。近年來隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，采用基因重組表達(dá)的特異性TP抗原包被固相板，使該方法具有更高的敏感性和特異性。李仕娟［11］報(bào)道 TRUST 法與 ELISA 法只有71.15%的陽性符合率，而TPPA法與ELISA法有99.12%的陽性符合率，因此用于篩查梅毒時(shí)，ELISA法檢出率會(huì)明顯高于TRUST法，是目前篩查梅毒的較理想方法。而且適用于大批量樣品的檢測(cè)，自動(dòng)化的操作方法，結(jié)果更為客觀準(zhǔn)確［12］。

2.2.4 膠體金層析法（CGD）。其原理是在檢測(cè)膜的檢測(cè)線上包被有基因重組TP抗原，當(dāng)加入樣品后，如果樣品中含有梅毒螺旋體抗體，將會(huì)與包被的特異性TP抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，而凝聚顯色［13］。該方法檢測(cè)的樣本可以是血漿、血清、全血，并且準(zhǔn)確率相對(duì)較高，具有簡(jiǎn)單、快速、不需要特殊儀器等特點(diǎn)［14］。主要用于獻(xiàn)血者篩查、性病門診快速檢測(cè)，以及緊急用血等特殊情況。但與ELISA法檢測(cè)結(jié)果比較，存在顯著差異，可能因出現(xiàn)“前帶現(xiàn)象”，有一定漏檢率［15］。強(qiáng)陽性標(biāo)本會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，需對(duì)樣本進(jìn)行稀釋處理。

2.2.5 免疫印跡法（WB）。是一種借助抗原鑒定特異性TP抗體的有效方法，該法是通過特異性TP抗體作為探針，與附著于固相支持物的通過電泳分離出來的特異性抗原表位發(fā)生特異性結(jié)合，是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。它結(jié)合了分子生物學(xué)和免疫學(xué)的特點(diǎn)，雖然特異性與敏感性都較高，但因檢測(cè)過程操作繁瑣，不適合于大批量的標(biāo)本檢測(cè)。同時(shí)試劑成本較高等，其在臨床中尚未得到廣泛應(yīng)用［16］。

2.2.6 化學(xué)發(fā)光法（CLIA）。是酶免疫技術(shù)發(fā)展的結(jié)果，采用多種特異性TP抗原包被固相發(fā)光微孔板，用辣根過氧化物酶標(biāo)記作為標(biāo)記抗原，與樣本中的梅毒螺旋體抗體特異性結(jié)合，形成雙抗原夾心復(fù)合物后，加入化學(xué)發(fā)光底物液，測(cè)定其發(fā)光值，判斷結(jié)果。CLIA是一種新型標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，用于微量抗原或抗體檢測(cè)。國內(nèi)一些研究表明：CLIA法具有操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易于保存，敏感度和特異度較高等優(yōu)點(diǎn)［17，18］，CLIA 法可以實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化檢測(cè)，適用于大批量樣本的檢測(cè)，該方法得到越來越廣泛的認(rèn)可。

2.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù) 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是檢測(cè)梅毒螺旋體的先進(jìn)方法。該方法的主要原理是通過持續(xù)進(jìn)行變性、退火、延伸，在體外大量擴(kuò)增模板DNA。選擇PCR診斷梅毒需要考慮患者所處的梅毒病程，及樣本來源以潰瘍和皮損拭子最為適宜。梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要是血清學(xué)檢測(cè)，但因人體感染梅毒后，要4～10周才產(chǎn)生一定數(shù)量的抗體，PCR可直接檢測(cè)梅毒螺旋體特異性基因片段，其特異性、敏感性均高于血清學(xué)方法［19］，尤其在早期梅毒診斷中意義重大。目前用于梅毒診斷的PCR技術(shù)主要有三種：即常規(guī)PCR、巢式PCR和熒光PCR。常規(guī)的PCR法檢測(cè)梅毒會(huì)出現(xiàn)一定假陰性，目前采用巢式PCR可提高對(duì)梅毒的檢出率。對(duì)于用血清學(xué)方法檢測(cè)為陰性或無法確證的結(jié)果，可采用巢式PCR檢測(cè)進(jìn)行確診［20］。熒光PCR對(duì)一期梅毒的診斷，具有很高的敏感性和特異性，可作為一期梅毒診斷的依據(jù)，對(duì)診斷二期梅毒不如血清學(xué)方法［21］。PCR檢測(cè)技術(shù)自身存在一些不足之處，易受樣本中細(xì)胞碎片和組織等物質(zhì)影響，對(duì)部分樣本如血清（全血）、腦脊液等敏感度低，出現(xiàn)漏診，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件及操作人員技術(shù)要求較高。

3 結(jié)語

梅毒的檢測(cè)技術(shù)在近年來得到快速發(fā)展，特異性和靈敏度不斷得到了提高，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便。但所有的梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷方法都有其局限性，有特殊的應(yīng)用范圍，原理和臨床意義各不相同，由于梅毒血清學(xué)檢測(cè)存在血清固定現(xiàn)象，檢測(cè)結(jié)果存在一定限制。目前還沒有單一的一種實(shí)驗(yàn)室方法，能完全診斷出梅毒感染及病程。血清學(xué)檢測(cè)仍然是梅毒螺旋體實(shí)驗(yàn)室診斷的主要方法，多為非特異性抗體與特異性抗體聯(lián)合檢測(cè)。梅毒螺旋體非特異性抗體檢測(cè)常用于大范圍篩查，特異性抗體檢測(cè)主要用于確證。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR檢測(cè)技術(shù)已廣泛深入到生命科學(xué)研究領(lǐng)域，是梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷的新方法，對(duì)早期梅毒、神經(jīng)梅毒和伴艾滋病感染梅毒等診斷顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在診斷梅毒時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)充分結(jié)合臨床，根據(jù)具體情形加以選擇檢測(cè)方法，需要綜合考慮檢測(cè)目的、特異性和敏感性、操作流程、樣本數(shù)量、試劑價(jià)格等因素。對(duì)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行組合優(yōu)化，建議兩種或兩種以上檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用，能有效提高梅毒檢出率，對(duì)梅毒的早診斷、早治療及控制梅毒蔓延有著重要意義［22］。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，更多有效可靠的梅毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新技術(shù)將應(yīng)用于臨床，需要今后不斷地總結(jié)研究。

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