早期糖尿病腎病新生物標志物的研究進展

張文濤(綜述),李社莉(審校)

(延安大學附屬醫(yī)院內分泌科，陜西 延安 716000)

糖尿病是一種常見的內分泌代謝性疾病，在過去的30年里,糖尿病患者的數(shù)量翻了一倍,已成為全球所有國家最重要的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴重和最常見的慢性微血管并發(fā)癥，是導致終末期腎病的最主要病因。目前DN復雜的發(fā)病機制和病理生理特點還沒有得到很好的理解。DN是否會發(fā)生，何種類型腎臟相關的臨床事件將會發(fā)生，以及DN如何發(fā)展，腎病如何恰當?shù)嘏R床分期和判斷療效情況，都需要合適的生物標志物。最近,特別是在人類基因組計劃的完成,蛋白質組學(系統(tǒng)分析蛋白質的身份、數(shù)量和功能)應用于DN的研究,使糖尿病相關生物標志物的研究出現(xiàn)飛速發(fā)展[2]。

1 腎小球功能障礙生物標志物

1.1鐵傳遞蛋白 鐵傳遞蛋白(transferrin，Tf)是肝臟合成的糖蛋白,正常情況下Tf不能通過腎小球濾過膜。早期腎損傷時腎小球基膜內外負電荷位點明顯減少,使循環(huán)中帶負電荷的分子蛋白Tf自腎小球濾過膜濾過出現(xiàn)在尿液中，主要反映腎小球濾過膜電荷選擇屏障受損。

Gonzalez等[3]采用免疫組織化學和免疫電鏡研究發(fā)現(xiàn)，Tf在糖尿病患者的腎小球足細胞的細胞質和腎小球囊細胞沉積，導致DN的發(fā)生。Kanauchi等[4]據(jù)尿微量白蛋白排泄的速率，將60例2型糖尿病患者分成正常白蛋白尿組、微量白蛋白尿組和臨床蛋白尿組，38例非糖尿病志愿者作為健康對照組。采用乳膠-免疫-比濁法對24 h的尿液標本進行檢測，結果顯示：微量轉鐵蛋白的發(fā)病率在正常白蛋白尿組、微量白蛋白尿組、臨床蛋白尿組分別為33.3%、63.2%和18.2%，明顯尿轉鐵蛋白的發(fā)病率分別為0、36.8%和81.8%。相對于非糖尿病對照組，2型糖尿病患者尿液Tf顯著增加，在2型糖尿病患者中，隨著腎小球彌漫性病變的進展,尿液中的Tf顯著增加，提示尿液Tf在檢測DN的早期階段可能是有用的。

1.2Ⅳ型膠原 Ⅳ型膠原(type Ⅳ collagen，Ⅳ-C)是構成腎小球基膜及腎小球膜基質的主要成分。Ⅳ-C穿透基膜在細胞外基質形成膠原纖維網(wǎng)構成基膜的主要框架，通過結合上面的細胞粘連分子發(fā)揮選擇性屏障作用。腎小球硬化發(fā)生纖維化時使Ⅳ-C合成增加，代謝減慢，積聚在基膜。DN患者的基膜增厚主要與Ⅳ-C代謝異常有關，隨糖尿病病程的延長其水平呈遞增趨勢，并與血糖控制水平有關。

Inoue等[5]通過酶免疫測定法檢測2型糖尿病患者尿液Ⅳ-C水平，結果顯示，2型糖尿病患者的Ⅳ-C水平隨腎病的發(fā)展而增加，即使在正常白蛋白尿時也明顯增加，提示Ⅳ-C水平的增高可能反映了細胞基膜或基質的結構在尚未出現(xiàn)微量白蛋白尿時已發(fā)生改變，研究結果提示,在2型糖尿病患者中檢測尿液Ⅳ-C對于發(fā)現(xiàn)早期階段DN有一定作用。Tan 等[6]使用夾心親和素-生物素復合法直接測量Ⅳ-C排泄率，研究表明有微量蛋白尿和大量蛋白尿的糖尿病患者其Ⅳ-C的排泄率均顯著高于非糖尿病患者，且Ⅳ-C隨著腎病等級的提高其排泄率逐漸增加。在正常白蛋白尿的2型糖尿病患者中Ⅳ-C 的排泄也是增加的。對膠原蛋白排泄升高的腎小球進行腎活檢表現(xiàn)出典型的DN的病理改變。研究結果提示，Ⅳ-C可能是早期DN的臨床有用的指標。Cohen等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，尿液Ⅳ-C與糖尿病患者的排泄和肌酐清除率呈負相關，尿液Ⅳ-C較高的患者腎功能逐漸惡化，提示尿液Ⅳ-C可作為監(jiān)視腎功能發(fā)展的指標。

2 腎小管功能障礙標志物

2.1中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是脂質運載蛋白家族的新成員，最先在人中性粒細胞中被發(fā)現(xiàn)，在前列腺和腎近曲小管細胞內水平最高，分子量較大，正常腎小球不能濾過，尿路中的NAGL主要來源于腎近曲小管的上皮細胞。研究表明，當機體受到有害的誘導，NGAL的表達就會大幅度增加[8]。

Yang等[9]對72例2型糖尿病患者隨訪研究發(fā)現(xiàn)，從正常蛋白尿組到臨床蛋白尿組，尿液中NGAL呈遞增趨勢。此外，尿液中NGAL與腎小球濾過率呈負相關，提示NGAL與腎功能密切相關，尿液中NGAL適用于DN的早期檢測和預測2型糖尿病腎病的進展。Bolignano等[10]對56例2型糖尿病患者的研究表明，2型糖尿病患者在沒有腎小球損害的早期征兆時(即沒有蛋白尿時)已有NGAL的增加，且其數(shù)值的增加與DN患者腎臟疾病的嚴重程度呈正相關，且與血肌酐、尿蛋白呈正相關，與腎小球濾過率呈負相關，提示NGAL測量可能成為一個有用的早期診斷早期腎病的標志物。Nielsen等[11]對1型糖尿病患者進行隨機干預隨訪研究顯示，NGAL的初期增高表明腎小管損壞處于初級階段，且與終末期腎病和死亡相關。

2.2尿上皮鈣黏著蛋白 尿上皮鈣黏著蛋白是一種維持血管內皮細胞極性和完整性必不可少的鈣黏著蛋白,是血管內皮細胞黏附連接的主要黏附蛋白，也是內皮細胞所特有的鈣黏著蛋白[12]。鈣黏著蛋白是一組介導同型細胞黏附連接的鈣依賴性Ⅰ型跨膜糖蛋白，正常腎組織中表達豐富，主要集中于腎小管上皮細胞的細胞膜及細胞互相接觸的間隙中。目前的研究表明，在炎癥情況下血管內皮細胞分泌一氧化氮、內皮素等自體活性物質，作用于血管內皮細胞鈣黏著蛋白的復合體致血管通透性增高，因此研究檢測可溶性鈣黏著蛋白水平可間接推斷是否存在血管內皮細胞損傷[13]。但隨著DN進展尿液中鈣黏著蛋白水平下降，而血清中的鈣黏著蛋白水平在2型糖尿病患者中比健康人顯著增高，提示糖尿病患者存在血管內皮細胞的損傷[14]。

Jiang等[15]基于熒光差異凝膠電泳和質譜分析方法檢測以確定尿液樣本中新的生物標志物，與對照組相比，尿液上皮鈣黏著蛋白在糖尿病組、DN1組和DN2組中其分別上調1.3倍、5.2倍和8.5倍。與DM組和對照組相比，DN1組和DN2組尿液上皮鈣黏著蛋白與肌酐比值顯著增加。尿液上皮鈣黏著蛋白診斷DN的靈敏度和特異度分別為78.8%(95%CI74～83)和80%(95%CI65～91)。此外，免疫組織化學染色顯示，與對照組相比，DN患者的腎小管上皮細胞上皮鈣黏著蛋白的表達顯著下降。研究結果提示，上皮鈣黏著蛋白可能參與DN的發(fā)病機制，尿液上皮鈣黏著蛋白在糖尿病早期腎病的診斷方面具有潛在的臨床診斷價值。

2.3腎臟損傷分子1 腎臟損傷分子1(kidney injury molecule-1，KIM-1)是一種跨膜糖蛋白,主要表達于人類腎臟,且在正常腎臟中并不表達,而在腎損傷發(fā)生后短時間內其表達明顯增加。研究表明,KIM-1的外功能區(qū)在金屬基質蛋白酶作用下斷裂為可溶性片段并能夠通過尿液排出,參與腎小管上皮細胞的早期損傷和修復過程，因此檢測尿中KIM-1水平可以間接評價腎小管損傷的情況[16]。

Kramer等[17]的一項隨訪研究顯示呈比例的減少蛋白尿可減少腎贓KIM-1的表達，提示KIM-1是潛在可逆性損傷的生物標志物。van Timmeren等[18]檢測不同腎臟疾病患者組及健康對照組尿液中KIM-1水平與腎損傷程度進行相關分析，結果表明,與正常對照組相比,在所有腎臟疾病患者的尿液中KIM-1水平均明顯增高。免疫組織化學檢測顯示,腎臟損傷時KIM-1與尿蛋白水平之間并沒有明確的相關關系，尿液中KIM-1排泄增多提示腎臟功能的下降。研究結果提示，KIM-1可作為監(jiān)測腎臟病損傷狀態(tài)的非侵入性生物標志物。Nielsen等[19]對148例1型糖尿病者的研究顯示，與55名健康對照組相比，在正常白蛋白尿、微量白蛋白尿、大量白蛋白尿的1型糖尿病患者中尿液KIM-1水平顯著增高，但尿液KIM-1在糖尿病不同蛋白尿組之間差異無統(tǒng)計學意義，提示尿液KIM-1可作為檢測腎小管損傷早期階段的生物標志物。

3 炎性反應生物標志物

3.1α酸性糖蛋白 α酸性糖蛋白(αl acidglycoprotein，AAG)是一種含糖量高達45%的急性時相反應蛋白，主要由肝巨噬細胞產(chǎn)生，感染應激等狀態(tài)下釋放出來，成為有活性的蛋白。尿液中AAG主要由血液中AAG經(jīng)腎臟濾出形成。Jain等[20]的研究首次提示了尿液AAG與DN的相關性，研究發(fā)現(xiàn)AAG只出現(xiàn)于糖尿病患者尿液中，即使檢測對照者尿液的尿微量白蛋白陽性，尿液AAG仍為陰性；在尿白蛋白排泄率正常的2型糖尿病患者發(fā)展為早期DN的過程中，AAG在尿液中的出現(xiàn)時間較尿微量白蛋白更早，提示尿液AAG可作為檢測腎損傷早期階段的生物標志物。Jiang等[21]使用二維凝膠電泳和質譜分析蛋白質組學的方法識別檢測12例DN患者(6例1型糖尿病和6例2型糖尿病患者)和6名健康對照者的尿液樣本中的生物標志物，然后通過免疫比濁法化驗檢測尿蛋白生物標志物水平，尿液樣本來自90例1型和2型糖尿病患者，其中包括正常蛋白尿組、微觀蛋白尿組、大量蛋白尿組(各組)和30名健康對照者。結果顯示，使用蛋白質組學方法確認了一個新穎的DN相關蛋白，即AAG。數(shù)據(jù)化驗顯示與對照組相比，尿液AAG排泄率在正常蛋白尿、微量蛋白尿和大量蛋白尿患者中逐漸增加，表明AAG排泄率在早期DN即增加且隨著DN的發(fā)展逐漸增加。研究結果提示，尿液AAG是一個與DN的發(fā)生和進展相關的早期生物標志物，此外AAG排泄率增加是DN的一個獨立危險因素。

3.2軟骨糖蛋白40 軟骨糖蛋白40 (chitinase-3-like-1 protein,YKL-40)，又稱幾丁質酶-3樣蛋白1，是一種炎癥性糖蛋白，可促進血管內皮功能障礙相關的趨化性，細胞黏附和遷移，重組和組織重構，血管內皮損傷的反應。YKL-40蛋白的表達被認為是在動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞和平滑肌細胞,其在早期動脈粥樣硬化病變的巨噬細胞中表達最高[22]。

Lee等[23]選擇75例2型糖尿病患者和22例非糖尿病對照者，使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒對血漿和尿液中的YKL-40的水平進行分析，結果表明血漿YKL-40顯著高于正常白蛋白尿糖尿病組且隨著糖尿病蛋白尿的增加而增加。血漿YKL-40與蛋白尿顯著相關，而尿液YKL-40與蛋白尿沒有表現(xiàn)出顯著的相關性。研究表明，尿液YKL-40的作用有限，而血漿YKL-40作為炎性標志物，是伴有蛋白尿的2型糖尿病腎病早期階段的一個獨立因素，并有可能作為一種非侵入性的有用標志物。Rondbjerg等[24]對105例2型糖尿病患者和20名健康對照組的研究及Sakamoto等[25]對131例年輕的1型糖尿病患者和97健康對照組的研究均表明，YKL-40水平與尿白蛋白排泄率相關，YKL-40可以預測評估1型糖尿病患者早期階段糖尿病微血管病的風險。

4 氧化應激生物標志物

尿8-羥基-2′脫氧鳥苷(8-hydroxy- 2′- deoxyguanosine，8-OHdG)是羥自由基在DNA堿基的C-4、C-5或C-8位置上與脫氧鳥嘌呤核苷酸殘基結合并進一步氧化產(chǎn)生的，最近已經(jīng)成為評估人類身體的氧化應激狀況的一種受歡迎的手段。

趙林雙等[26]隨機選擇DN患者71例，糖尿病患者73例及健康對照者47例，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗法測定其血清8-OHdG水平，結果8-OHdG水平在DN組顯著高于糖尿病組，糖尿病組顯著高于健康對照組，大量蛋白尿組明顯高于微量蛋白尿組。研究結果提示，DN與血清8-OHdG水平有關。檢測尿8-OHdG水平預測DN發(fā)展是一個有用的早期臨床標志物。

Serdar等[27]對52例2型糖尿病患者(32例腎病患者,20無腎病患者)和20名健康對照組進行研究，使用液相色譜-質譜/液相色譜法測定尿液中8-OhdG水平及第1日上午尿白蛋白/肌酐比值，結果表明，有或無腎病的2型糖尿病患者尿8-OHdG水平增加比較差異無統(tǒng)計學意義。然而，較尿白蛋白/肌酐比值，尿液8-OhdG水平在預測糖尿病患者DN的發(fā)展中不是一個有用的早期臨床標志物。

5 小 結

DN生物標志物的研究取得了一些積極的進展，但仍需做大量的基礎和臨床工作。除采用蛋白質組學等新技術發(fā)現(xiàn)一些新的生物標志物外，另一個重要的研究方向是采用新的生物信息學方法重新整合分析已有的信息，從而更全面、深入地了解DN的發(fā)病機制及病理生理特點，發(fā)現(xiàn)更特意的DN早期診斷生物標志物，從而早期保護腎功能，減少終末期腎病的發(fā)生。

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