間充質(zhì)干細(xì)胞治療周圍神經(jīng)損傷的研究進展

張 杰(綜述)，肖玉周(審校)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，安徽 蚌埠 233004)

周圍神經(jīng)損傷原因有外科創(chuàng)傷、腫瘤切除、糖尿病足等，因其結(jié)構(gòu)上的脆弱性和功能上的復(fù)雜性，所以一旦損傷就會造成支配區(qū)域的感覺運動和自主神經(jīng)的功能障礙。臨床上遇到此類病例主要是采用直接縫合法、自體神經(jīng)移植或異體甚至異種神經(jīng)移植，但以上幾種方法的自身缺點而限制了其在臨床中的應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，組織工程學(xué)應(yīng)運而生，其三要素是支架、種子細(xì)胞和營養(yǎng)因子。種子細(xì)胞由施萬細(xì)胞到后來的基質(zhì)干細(xì)胞，再到誘導(dǎo)的類施萬細(xì)胞。該文主要就種子細(xì)胞即施萬細(xì)胞及其前體細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進展予以綜述，重點在目前還未解決的問題，以期為進一步的研究重點做鋪墊。

1 周圍神經(jīng)損傷的病理生理變化

針對長段的神經(jīng)缺損人們已經(jīng)進行了大量的基礎(chǔ)研究和部分的臨床試驗，證實選擇合適的人工神經(jīng)移植物對修復(fù)一定長度的神經(jīng)缺損有促進作用[1]。施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)中重要的膠質(zhì)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)受損后，局部發(fā)生變性，施萬細(xì)胞大量增生形成Bungner帶，并與周圍的巨噬細(xì)胞一起吞噬清除變性的軸突和髓鞘裂解物，并能分泌包括神經(jīng)生長因子在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子[2]。雖然施萬細(xì)胞是修復(fù)周圍神經(jīng)的優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞，但要將其用于組織工程還有很多困難。施萬細(xì)胞的來源主要有三個，即自體施萬細(xì)胞分離增殖、異體施萬細(xì)胞分離增殖、干細(xì)胞增殖分化。自體施萬細(xì)胞因其來源有限且會造成供區(qū)的神經(jīng)缺損，異體施萬細(xì)胞因存在排斥反應(yīng)而使前兩者應(yīng)用受到限制。因此，研究者把目光轉(zhuǎn)向了干細(xì)胞的分離擴增分化上來。這一研究可能會使既往認(rèn)為的神經(jīng)組織不可修復(fù)不可再生的觀點得以改變[3]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞的特性

間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中的一種具有強大的繁殖能力、多向分化潛能及免疫調(diào)節(jié)功能的來源于中胚層的細(xì)胞,是一種具有高度的自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，因其具有免疫調(diào)控、分泌細(xì)胞因子等作用而成為細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞[4]。在一定的誘導(dǎo)條件可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和再生能力極差的神經(jīng)細(xì)胞[5-6]。不僅可用于組織工程，還可為其他細(xì)胞的生長繁殖提供支持。因具有來源廣泛、易于分離提純擴增等優(yōu)勢而日益成為研究熱點[7]。除此之外,間充質(zhì)干細(xì)胞還有如下特性：①“歸巢”性，即像免疫細(xì)胞一樣，有向受傷或有炎癥的局部遷徙的特性；②低免疫原性，目前臨床已有大量利用間充質(zhì)干細(xì)胞治療移植物抗宿主病和自身免疫病，這足以證明其免疫原性弱[8]。間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，具有很高的可塑性及自我繁殖能力，主要來源于骨髓、脂肪、臍帶血、臍帶等。對間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定及純度的測定是非常重要的,因其缺乏特異性的表面標(biāo)志物，因此只能通過檢測一系列的分子指標(biāo)來鑒定[9]。目前比較公認(rèn)的是國際細(xì)胞療法學(xué)會制訂的標(biāo)準(zhǔn)：①體外培養(yǎng)具有貼壁性；②表面分子需表達CD105、CD73、CD90，不表達CD34、CD45、CD19等；③有自我更新能力及多向分化潛能[10]。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究歷程及各自特點

研究最早的間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓來源的，也是目前研究技術(shù)相對成熟的施萬細(xì)胞來源，已證實其可分化為骨、軟骨、脂肪等細(xì)胞，且免疫原性也較低。但是隨著研究的進展也發(fā)現(xiàn)了骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞有很多不足之處，主要有取材時會對供體造成傷害或感染，隨著供者年齡的增大干細(xì)胞數(shù)量下降及增殖和分化能力會降低[11]。胚胎干細(xì)胞因涉及法律和倫理的問題而使研究受到限制。新世紀(jì)以來又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)臍帶血中亦含有間充質(zhì)干細(xì)胞，并有來源豐富、取材無創(chuàng)、增殖能力強、免疫原性弱、無倫理學(xué)爭議、無腫瘤細(xì)胞、費用低等優(yōu)勢,且其治療效果不亞于骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞[12-13]。有研究表明,臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子和神經(jīng)生長因子等，在疾病治療方面起重要作用[14]。但臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞含量少，據(jù)統(tǒng)計只有25%臍血的單核細(xì)胞培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，其余75%培養(yǎng)出破骨樣細(xì)胞[15]。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物區(qū)別在于臍血的CD90和CD166的表達水平高于骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，提示臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的骨祖細(xì)胞含量較豐富。

4 國內(nèi)外研究已取得的進展

目前多數(shù)研究者認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞的修復(fù)機制可能是旁分泌機制，即細(xì)胞移植入體內(nèi)后大部分死亡，釋放膜微囊趨化并調(diào)節(jié)周圍細(xì)胞的功能，少數(shù)存活的細(xì)胞通過分泌大量的小分子物質(zhì)發(fā)揮作用[16]。針對間充質(zhì)干細(xì)胞難培養(yǎng)，尤其是獲取早期數(shù)量比較少的情況，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)生物反應(yīng)器3D的培養(yǎng)模式效果比較好，因為其在相同的體積下培養(yǎng)的表面積比較大，系統(tǒng)封閉，種植和收獲可以自動化[17]。通過對細(xì)胞植入體內(nèi)后的跟蹤發(fā)現(xiàn)一種納米粒技術(shù)，能夠抵御體內(nèi)的干細(xì)胞代謝性降解，是長期跟蹤干細(xì)胞發(fā)展的一種好方法，可以探究移植物從植入到凋亡的全過程[3]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)端粒酶在維持細(xì)胞染色體的穩(wěn)定性方面起著重要的作用，因此研究端粒酶對檢測及預(yù)防細(xì)胞的凋亡會有一定的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞與許旺細(xì)胞在體外共培養(yǎng)可促進干細(xì)胞向施萬細(xì)胞的分化[18]。有研究表明，骨髓來源的施萬細(xì)胞在受損髓鞘局部有再生的能力[19]?，F(xiàn)已證明貼壁實驗是目前檢測細(xì)胞活性較為實用的一種方法[20]。間充質(zhì)干細(xì)胞用于修復(fù)周圍神經(jīng)途徑主要有以下幾個方面：①直接注入受損區(qū)域；②誘導(dǎo)為施萬細(xì)胞后注入受損區(qū)域；③制成人工神經(jīng)移植物植入受損區(qū)。有研究表明,直接注入處理后的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞對糖尿病足引起的周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)有促進作用[21]。組織移植安徽省重點實驗室已成功把骨髓和臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為施萬細(xì)胞并進行了相關(guān)的鑒定，對誘導(dǎo)方法進行了優(yōu)化，在動物體內(nèi)模型進行了研究并證實了由臍血間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)而來的施萬細(xì)胞對修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)受損有促進作用?，F(xiàn)在研究者已認(rèn)識到分化是細(xì)胞和環(huán)境相互作用的結(jié)果，主要是通過調(diào)控基因的表達起作用。五代以內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞可自行分泌腺苷三磷酸分子，并可與細(xì)胞膜結(jié)合后改變膜內(nèi)外電位，從而引起膜電位變化[22]。經(jīng)典的Wnt通路參與了間充質(zhì)干細(xì)胞的分化調(diào)控[23]。反復(fù)的微熱刺激能夠防止衰老的進展，這為其大規(guī)模的擴增增加了更多的機會。間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化機制目前主要有三種學(xué)說，即異質(zhì)性學(xué)說、核重編程學(xué)說(包括細(xì)胞融合)和胚胎干細(xì)胞殘存學(xué)說。

5 大量應(yīng)用于臨床前尚需解決的問題

目前存在的不足和問題，主要分為以下幾個方面：①神經(jīng)受損后修復(fù)的速度非常慢，修復(fù)后功能的恢復(fù)有待考證。②神經(jīng)移植物在體內(nèi)是否能降解，降解的速度是否和神經(jīng)恢復(fù)的速度相適應(yīng)。③運動神經(jīng)的恢復(fù)速度比感覺神經(jīng)快，是否會引起感覺與運動不協(xié)調(diào)。④受損后的神經(jīng)恢復(fù)很難達到之前正常的水平。⑤誘導(dǎo)后植入體內(nèi)的細(xì)胞是否殘存有誘導(dǎo)劑及其對體內(nèi)正常細(xì)胞的毒性尚不知曉。⑥有報道稱腫瘤是間充質(zhì)干細(xì)胞異常分化而來的，因此植入的細(xì)胞是否有惡變及其比例需進一步研究[24]。⑦機體局部受損后多處于相對缺氧和缺血狀態(tài)，會影響植入的施萬細(xì)胞活性的表達。⑧目前的大多實驗還處于實驗室階段，是人工模擬的環(huán)境，但真實的體內(nèi)環(huán)境極其復(fù)雜，勢必會對植入物產(chǎn)生一定的影響。⑨周圍神經(jīng)修復(fù)和功能的評價目前還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，可能使不同的實驗缺乏對比性。⑩移植物移植到體內(nèi)后是否穩(wěn)定，有無“返祖”現(xiàn)象。有報道稱直接把間充質(zhì)干細(xì)胞注入體內(nèi)的效果優(yōu)于誘導(dǎo)后的施萬細(xì)胞，因此誘導(dǎo)的必要性需要進一步研究[25]。人工神經(jīng)植入體內(nèi)促進神經(jīng)修復(fù)的具體機制尚不清楚。有關(guān)植入體內(nèi)后的遠(yuǎn)期效果報道甚少，有無異位骨化和凋亡等形成。間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化及擴增等方法還不夠完善。移植的時機、移植的數(shù)量、移植后存活及長期療效、移植后能否控制其增殖的速度。有報道稱間充質(zhì)干細(xì)胞有腫瘤組織趨向性，但其效果是促進還是抑制腫瘤生長仍有爭議。有研究者稱間充質(zhì)干細(xì)胞會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[6]。而有的研究者則稱間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[26]。細(xì)胞移植入體內(nèi)后的存活率較低且差異較大，介于0.5%～38.0%之間，可能與細(xì)胞的種類和植入的時間點有關(guān)[27]。目前比較一致的看法是十代以內(nèi)的細(xì)胞基因型基本是穩(wěn)定的，但隨著代數(shù)的增多其致瘤風(fēng)險會增大。有研究表明植入后的細(xì)胞活性比在體外培養(yǎng)時要低，因此如何保持和提高細(xì)胞活性需進一步研究[28]。干細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境由哪些成分組成，這些成分又是如何調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值和分化的。植入體內(nèi)的利與弊如何衡量。體外人工擴增后真正具有功能的間充質(zhì)干細(xì)胞比例是多少。體外培養(yǎng)的細(xì)胞活性低，移植前細(xì)胞活性的檢測對治療效果影響非常大[29]。目前多采用椎蟲藍(lán)染色來檢測細(xì)胞的活性[30-31]。但還未獲得大范圍推廣。有報道稱在體內(nèi)環(huán)境下的培養(yǎng)有利于類施萬細(xì)胞的增殖，但目前的實驗擴增多在體外模擬環(huán)境下進行[32]。體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與血清、細(xì)胞因子等直接接觸，易受熱源和內(nèi)毒素的污染，有造成醫(yī)源性感染的風(fēng)險。

6 小結(jié)與展望

只有將間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)、作用的具體機制、分化細(xì)胞表型、能否分泌神經(jīng)遞質(zhì)及量的多少等問題研究清楚后，才能進一步應(yīng)用于臨床[33]。許多組織中間充質(zhì)干細(xì)胞含量較少，因此想在臨床上應(yīng)用必須在體外進行大量的擴增。體外擴增是在人工環(huán)境下進行的，擴增后的細(xì)胞就可能與從組織中新提取的在生物學(xué)方面有所區(qū)別，可能會造成醫(yī)源性的不良反應(yīng)[34]。間充質(zhì)干細(xì)胞分化需要人工的調(diào)控，分化后細(xì)胞的純度值得商榷。衰老是所有有機體的共同特征，干細(xì)胞也不例外，因此建立檢測衰老的程度和比例的系統(tǒng)和防止或延緩衰老進展非常重要。有研究稱體外培養(yǎng)嚴(yán)重影響植入性，植入的細(xì)胞最終要被受體自身的細(xì)胞所替代[16]。在應(yīng)用于臨床之前，移植的成本、安全性，移植后的有效檢測是急需解決的問題[35]。

相信隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以上提到的問題與不足會逐一解決，間充質(zhì)干細(xì)胞的眾多優(yōu)勢定能發(fā)揮出來，給人們的未來帶來新的希望，周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)一定會取得突破性進展。

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