應(yīng)用組織特異性分子的保守序列鑒定人源細(xì)胞的組織來源

孫 昊，劉玉琴，卞曉翠，楊振麗，趙曉梅

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理學(xué)系細(xì)胞資源中心，北京 100005）

體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源是目前醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛、最重要的實(shí)驗(yàn)工具之一，使用背景清楚的細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)可靠的關(guān)鍵。尤其是人類細(xì)胞用于發(fā)病機(jī)制研究及藥物研發(fā)，要求往往更為嚴(yán)格。被交叉污染細(xì)胞的使用，雖然很早已被認(rèn)識(shí)，但近年來隨著實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的更廣泛應(yīng)用，其擴(kuò)大的趨勢(shì)與實(shí)驗(yàn)要求的提高形成了巨大反差。本實(shí)驗(yàn)室早先已對(duì)于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的種屬鑒定［1］和細(xì)菌、支原體污染鑒定做了深入研究，STR檢測(cè)分析用于識(shí)別人類細(xì)胞的個(gè)體起源。本實(shí)驗(yàn)建立同一個(gè)體不同組織起源的鑒定新方法。眾所周知，細(xì)胞可以通過形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)細(xì)胞的組織來源進(jìn)行初步分析，但要準(zhǔn)確分析，很多實(shí)驗(yàn)室和保藏中心往往采用抗原抗體爬片、Western blot和基因芯片大通量測(cè)序等方法，其比較耗時(shí)耗力，成本也高，且常常參比標(biāo)準(zhǔn)不明顯，易受外在條件干擾。本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)17個(gè)分子進(jìn)行組織特異性驗(yàn)證，篩選出可用于鑒定常見細(xì)胞組織起源的指標(biāo)，并對(duì)部分庫藏細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)中所有細(xì)胞及培養(yǎng)基都由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供（表1），所有細(xì)胞的培養(yǎng)方法按常規(guī)進(jìn)行。

1.2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞mRNA的提取純化和cDNA的合成

應(yīng)用Trizol（Takara公司）試劑進(jìn)行細(xì)胞mRNA的提取，氯仿/無水乙醇純化，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。對(duì)提純的mRNA紫外分光光度儀（Ⅵ trospec 2100 pm）上讀取 A260、A280和 A230以檢測(cè)mRNA的濃度及純度;應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）PCR合成cDNA，cDNA經(jīng)紫外分光光度儀（Ⅵtrospec 2100 pm）上讀取 A260、A280和 A230以檢測(cè)cDNA的濃度及純度。以100 ng cDNA為模板，以人類和小鼠通用GAPDH引物（GAPDH-F:5-GGTGA AGGTCGGAGTCAACG-3;GAPDH-R:5-GGCAGTGA TGGCATGGACTG-3）于55℃退火進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)cDNA。

表1 研究中實(shí)驗(yàn)組和驗(yàn)證組所使用細(xì)胞Table 1 List of cell lines of training and test group

1.3 組織特異性引物的選擇及合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及NCBI數(shù)據(jù)庫中信息，選取17種細(xì)胞組織特異性的組織因子，并根據(jù)這些特異組織因子mRNA的結(jié)構(gòu)和保守序列設(shè)計(jì)針對(duì)的引物（表2），引物由Invitrogen公司合成。

1.4 引物特異性的篩選

以50～100 ng已知細(xì)胞cDNA為模板，與上述17對(duì)組織特異性引物以最適退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，判斷引物是否可對(duì)特定組織來源cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增。條帶的位置及分子質(zhì)量符合預(yù)期為陽性對(duì)照;以無菌水為陰性對(duì)照。

1.5 引物敏感性的檢測(cè)

以篩選出的9對(duì)引物和對(duì)應(yīng)細(xì)胞cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選擇有代表性細(xì)胞cDNA為底物。細(xì)胞 cDNA 分別取 100、50、25、10、1、0.1、0.01 和0.001 ng作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶以判斷引物的敏感性。

1.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

引物特異性篩選和引物敏感性檢驗(yàn):冰上混合20 μL反應(yīng)體系（Takara公司），于PCR反應(yīng)儀（G-STORM）上進(jìn)行擴(kuò)增，95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，以摸索出的各引物最適溫度退火30 s，72℃1 min，32個(gè)循環(huán)后72℃再延伸10 min。通過向反應(yīng)體系中加入MgCl2，使退火溫度統(tǒng)一在61℃左右，便于在雙盲條件下對(duì)檢測(cè)細(xì)胞組織來源新方法進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 人類細(xì)胞組織鑒定的特異性引物序列Table 2 Sequences of human tissue specific primers

1.7 雙盲法檢測(cè)未知細(xì)胞組織來源

細(xì)胞培養(yǎng)及mRNA提取、RT-PCR由不同人員完成。細(xì)胞培養(yǎng)者收集細(xì)胞，進(jìn)行樣品編號(hào)。提取mRNA由專人完成。僅以帶數(shù)字編號(hào)的mRNA給予后繼實(shí)驗(yàn)者。后繼實(shí)驗(yàn)人員反轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA，以50～100 ng待檢測(cè)細(xì)胞 cDNA為模板，將上述初選得到的17對(duì)組織特異性引物，以95℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)后72℃再延伸10 min，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，參照上述篩選引物擴(kuò)增出的條帶，判斷該編號(hào)細(xì)胞的組織來源。與進(jìn)行編號(hào)的工作人員比對(duì)樣品信息，驗(yàn)證新方法是否有效、準(zhǔn)確。

2 結(jié)果

2.1 提取細(xì)胞mRNA及合成cDNA的質(zhì)量檢測(cè)

提取的哺乳動(dòng)物細(xì)胞mRNA A260/A280在1.8～2.0之間（提示蛋白含量低）。反轉(zhuǎn)錄cDNA以GAPDH引物擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳條帶均一、致密、分子質(zhì)量在540 bp（圖1）的為合格樣品。對(duì)于降解的樣品，重新培養(yǎng)細(xì)胞，重新提取mRNA。

2.2 引物特異性的篩選

擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果（圖2）。由此可見，其中 ALB、AFP、LCA和CHD16的4對(duì)引物只能從與其相應(yīng)組織來源的細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增出目標(biāo)分子質(zhì)量的條帶，無其他雜帶，說明這4對(duì)引物有較好的組織特異性。但是針對(duì) SFPDH、FLT、MUL2和SYN的引物除有目的條帶（285、173、264和128 bp）外，還有背景條帶，但是這些背景條帶的分子質(zhì)量與目標(biāo)條帶的大小相差較遠(yuǎn)，不影響結(jié)果判斷。另外還需要說明的是，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，針對(duì)PSA蛋白mRNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)的引物可廣泛在人類內(nèi)皮、上皮來源細(xì)胞中擴(kuò)增出明顯條帶（小鼠細(xì)胞除外），不具組織特異性。其原因可能是該引物擴(kuò)增mRNA序列在人類細(xì)胞中廣泛表達(dá)或可能具有種屬特異性，有待進(jìn)一步研究。經(jīng)特異性和敏感性檢測(cè)后篩選得的9對(duì)引物（表3）。

2.3 引物敏感性的檢測(cè)

9對(duì)引物在10 ng cDNA模板時(shí)都能得到清晰可見的條帶;有的引物如ALB甚至在模板量低至0.01 ng時(shí)仍可以看到較清晰的條帶;9對(duì)引物中敏感性較差的引物如 MUL2、FLT和 PSA等在1 ng cDNA時(shí)也可以看到較弱的條帶（圖3）。

圖1 細(xì)胞cDNA內(nèi)參GAPDH擴(kuò)增結(jié)果Fig 1 PCR amplification with GAPDH primers and cDNA

表3 人類組織來源、組織特異因子、PCR結(jié)果對(duì)應(yīng)關(guān)系Table 3 Tissue specific indicators of human cells by RT-PCR

圖2 RT-PCR擴(kuò)增的組織特異性檢測(cè)電泳圖Fig 2 Tissue specificity of the RT-PCR amplification analyzed by 2%agarose gel electrophoresis

2.4 應(yīng)用篩選出的8個(gè)組織細(xì)胞特異因子鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的起源

對(duì)編號(hào)樣品的檢測(cè)結(jié)果（圖4），與培養(yǎng)細(xì)胞的編號(hào)人員比對(duì)，10個(gè)編號(hào)細(xì)胞經(jīng)由此方法所判斷的組織來源與初始信息相吻合。表明此法對(duì)鑒定細(xì)胞組織來源有效。

圖3 種屬特異性引物PCR擴(kuò)增的敏感性檢測(cè)Fig 3 Sensitivity of RT-PCR amplification analyzed by 2%agarose gel electrophoresis with corresponding primers

3 討論

交叉污染或錯(cuò)誤鑒定細(xì)胞的使用越來越廣泛，已嚴(yán)重影響了科研質(zhì)量，必須停止使用。細(xì)胞存在交叉污染占細(xì)胞資源的17% ～35%，其中一大部分是同物種乃至同個(gè)體不同組織來源細(xì)胞的混雜。對(duì)于細(xì)胞組織來源的檢測(cè)手段包括細(xì)胞形態(tài)分析、Western blot、免疫組化和基因芯片測(cè)序等方法。這幾種方法比較粗糙或繁瑣、耗時(shí)耗力，成本高昂，所以本論文研究通過篩選驗(yàn)證組織特異性因子表達(dá)，建立RT-PCR法鑒定細(xì)胞的組織來源的方法。

根據(jù)文獻(xiàn)選擇了17個(gè)組織細(xì)胞特異因子。依據(jù)如下:血清白蛋白（ALB）基因轉(zhuǎn)錄有較高的水平，CCAAT盒、TATA盒以及HNF1為ALB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)該基因在肝臟特異性表達(dá)［9］。甲胎蛋白（AFP）不存在于健康成人組織，其主要在異常功能的肝細(xì)胞中合成，在成人中具有組織特異性［6］。酪氨酸激酶受體（Flt-1）是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子之一，F(xiàn)LT-1特異性地表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和上調(diào)的腫瘤脈管系統(tǒng)［4］。囊泡錨定蛋白（synapsin）是一種存在于大小突觸囊泡的神經(jīng)元特異性磷酸化蛋白。非神經(jīng)元細(xì)胞廣泛表達(dá)NRSF/REST蛋白，其抑制Synapsin在非神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)［8］。表面活性蛋白家族（SFTPA、B、C和D）是肺發(fā)揮正常表面活性劑功能和激素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，SFTPB選擇特異性地表達(dá)于肺細(xì)支氣管和肺泡上皮細(xì)胞［10］。LCA（CD45）也稱為白細(xì)胞共同抗原，由所有造血細(xì)胞除紅細(xì)胞和血小板完全表達(dá)，在T淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原刺激的細(xì)胞增殖和胸腺發(fā)育起關(guān)鍵作用［11］。鈣黏蛋白（CDH16）為膜結(jié)合糖蛋白員，在腎系統(tǒng)中特異性表達(dá)［2］。黏蛋白（MUL）是一類高分子量高度糖基化蛋白，在動(dòng)物上皮組織細(xì)胞中產(chǎn)生，具有細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、化學(xué)屏障功能［3］。

圖4 9個(gè)編號(hào)細(xì)胞的RT-PCR檢測(cè)預(yù)判電泳與初始信息比對(duì)Fig 4 Gel electrophoresis of the PCR products from unknown 9 number cells compares with initial information

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中信息，設(shè)計(jì)17對(duì)引物，分別對(duì)應(yīng)前述16種編碼組織特異性因子的mRNA保守序列，并檢測(cè)分析其組織特異性。使用背景明確的已知細(xì)胞的mRNA，經(jīng)RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)分析判斷其特異性和敏感性。確定其中8對(duì)引物，這8對(duì)引物有較好的特異性和敏感性，特異性因子ALB、AFP、SYN、CDH16、SFTPB、LCA、FLT 和 MUL2 的對(duì)應(yīng)引物可有效應(yīng)用于鑒定細(xì)胞是否源自肝、腎、神經(jīng)、肺、造血、內(nèi)皮和分泌組織;特異性因子PSA對(duì)應(yīng)引物在人類各組織細(xì)胞均擴(kuò)增出條帶，但小鼠細(xì)胞中未見擴(kuò)增帶。經(jīng)雙盲法，利用編號(hào)的未知起源的細(xì)胞 mRNA，進(jìn)行細(xì)胞起源的鑒定，可以鑒定HEPG2、SKNSH、A549、A498、K562、THP 等諸多細(xì)胞的組織起源。

以上結(jié)果證實(shí)，這種RT-PCR方法敏感、特異，而且價(jià)格低廉，能快速地鑒定實(shí)驗(yàn)人類細(xì)胞的組織來源，應(yīng)用于未知細(xì)胞的組織來源和已知細(xì)胞是否出現(xiàn)種內(nèi)組織交叉污染的初篩。但是，本研究只選得了7種組織鑒定的特異引物，對(duì)其他組織鑒定可用的特性因子的PCR檢測(cè)體系還有待繼續(xù)完善，操作方法有待進(jìn)一步簡(jiǎn)化提高。另外，隨著保藏細(xì)胞的增加，仍需要擴(kuò)大檢測(cè)的范圍。

［1］卞曉翠，劉玉琴，王春景，等.應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的來源種屬［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，29:424-430.

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