小鼠皮質(zhì)神經(jīng)祖細(xì)胞分化過(guò)程中Twist1的功能

付紅燁，陰 彬，彭小忠

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005）

大腦皮質(zhì)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成部分，是完成學(xué)習(xí)、語(yǔ)言和記憶等各種生物學(xué)功能最主要的器官。神經(jīng)系統(tǒng)起源于外胚層，發(fā)育早期，神經(jīng)外胚層內(nèi)陷閉合形成神經(jīng)管，神經(jīng)管前端的神經(jīng)上皮細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為神經(jīng)祖細(xì)胞，最后發(fā)育成為大腦［1］。神經(jīng)祖細(xì)胞分布于皮質(zhì)內(nèi)側(cè)的室管膜區(qū)（ventricular zone，VZ），其增殖與分化受多種基因與信號(hào)通路的調(diào)控，例如，Wnt通路成員β-catenin可以通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Pax6維持神經(jīng)祖細(xì)胞的自我更新［2］。

堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）模體是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域，含有此結(jié)構(gòu)域的蛋白大多與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化以及命運(yùn)決定相關(guān)，這類蛋白在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中起到重要的作用。Twist是bHLH蛋白家族的成員之一，最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，是果蠅原腸胚形成以及中胚層發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子。Twist基因家族在人和小鼠等物種中非常保守［3］。Twist1是脊椎動(dòng)物中Twist的同源基因，在小鼠中Twist1的功能與中胚層及神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育相關(guān)［4-6］，而Twist1在大腦皮質(zhì)發(fā)育中的作用少有報(bào)道，本研究以小鼠為研究對(duì)象，初步探討Twist1在皮質(zhì)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)及功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)ICR小鼠［8～10周齡，26～30 g，北京維通利華公司，合格證號(hào):SCXK（京）2012-0001］;HEK-293ET細(xì)胞系（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所蔣澄宇教授饋贈(zèng)）;pGEM-T質(zhì)粒載體（Promega公司）;pCAGIG質(zhì)粒載體（耶魯大學(xué)鐘偉民教授饋贈(zèng)）;DNA聚合酶、DNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒及RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）;DNA內(nèi)切酶（New England Biolabs公司）;DNA凝膠純化回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒（天根生化科技有限公司）;去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒（Qiagen公司）;Twist1抗體（sc-15393，Santa Cruz公司）;PAX6抗體（PRB-278P，Convance公司）;地高辛標(biāo)記的 NTP、地高辛抗體、NBT/BCIP顯色試劑（Roche公司）;DMEM完全培養(yǎng)基、胎牛血清（HyClone公司）;Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）。

1.2 Twist1基因過(guò)表達(dá)克隆的構(gòu)建

Twist1基因序列獲取自NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，擴(kuò)增基因編碼區(qū)的引物如下:正向:5'-CTCGAGCCACCA TGATGCAGGACGT-3'，反向:5'-GAATTCTAGTGGG ACGCGGACATGGA-3'。PCR片段及載體的酶切及連接反應(yīng)按說(shuō)明書操作進(jìn)行，將基因片段與pGEM-T連接用于測(cè)序及探針制作。Twist1的過(guò)表達(dá)克隆所用載體為pCAGIG，pCAGIG載體在多克隆位點(diǎn)后含有一段內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）起始的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）編碼序列，過(guò)表達(dá)基因的同時(shí)也會(huì)介導(dǎo)GFP蛋白表達(dá)，綠色熒光可以示蹤轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。質(zhì)粒提取按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK-293ET細(xì)胞培養(yǎng)基為:DMEM完全培養(yǎng)基+10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，細(xì)胞隔天傳代1次，傳代比例1∶5。用作轉(zhuǎn)染時(shí)，鋪板細(xì)胞濃度為2×108/L，鋪板24 h內(nèi)細(xì)胞匯合達(dá)到80%左右時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，質(zhì)粒終濃度1.6 mg/L，以不含基因過(guò)表達(dá)序列的空載體作為對(duì)照，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書步驟操作，48 h后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平變化。

1.4 Western blot檢測(cè)Twist1蛋白表達(dá)

貼壁細(xì)胞棄去培養(yǎng)基后用生理鹽水洗兩次，加裂解液提取總蛋白。細(xì)胞總蛋白裂解液配方為:50 mmol/L Tris，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA和1%Triton X-100，用前加入蛋白酶抑制劑。冰上裂解，4℃ 12 500 r/min離心30 min，收集上清。按常規(guī)蛋白變性凝膠電泳進(jìn)行分離，Western blot檢測(cè) Twist1蛋白表達(dá)量變化，Twist1抗體稀釋比例1∶200。

1.5 原位雜交檢測(cè)Twist1在皮質(zhì)中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)選取 E12.5、E14.5、E16.5和 E18.5等4個(gè)發(fā)育天數(shù)小鼠腦組織，進(jìn)行mRNA原位雜交實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Twist1在皮質(zhì)的表達(dá)情況。胚胎取出后用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定10 h，25%蔗糖脫水，用冰凍切片包埋劑進(jìn)行包埋，低溫冰凍切片。Twist1原位雜交探針通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成，通過(guò)測(cè)序檢測(cè)序列與pGEM-T載體連接方向確定轉(zhuǎn)錄方向，以地高辛標(biāo)記的NTP為底物，從基因的反方向轉(zhuǎn)錄出與編碼序列互補(bǔ)的探針序列，轉(zhuǎn)錄按照Takara體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作。原位雜交按照常規(guī)步驟進(jìn)行，探針終濃度0.2 mg/L，地高辛抗體稀釋比例1∶2 000，顯色反應(yīng)使用NBT/BCIP顯色試劑，按說(shuō)明書操作。

1.6 胚胎子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)檢測(cè)Twist1過(guò)表達(dá)效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)使用電穿孔轉(zhuǎn)染Twist1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染孕期13.5 d的ICR小鼠胚胎，使用0.7%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，注射及轉(zhuǎn)染操作參照已發(fā)表文章步驟進(jìn)行［7］，轉(zhuǎn)染所用質(zhì)粒為去內(nèi)毒素的Twist1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，濃度大于2 g/L，每只胚胎質(zhì)粒用量約2 μL，電轉(zhuǎn)所用電壓為30 V。操作完成后縫合手術(shù)傷口，常規(guī)飼養(yǎng)，72 h后收取胚胎腦組織。組織切片按上述方法進(jìn)行，切片用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)，PAX6抗體稀釋比例 1∶300。

2 結(jié)果

2.1 Twist1在大腦皮質(zhì)的表達(dá)

組織切片的原位雜交結(jié)果顯示，Twist1在小鼠皮質(zhì)發(fā)育的4個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，表達(dá)部位主要位于室管膜區(qū)，皮質(zhì)中也有一定表達(dá)（圖1）。

2.2 Twist1過(guò)表達(dá)克隆的驗(yàn)證

HEK-293ET細(xì)胞轉(zhuǎn)染Twist1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒48 h后，可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)GFP蛋白（圖2A）。Western blot免疫印跡結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，Twist1過(guò)表達(dá)以后可以檢測(cè)到蛋白表達(dá)量升高（圖2B）。

2.3 Twist1在神經(jīng)祖細(xì)胞中的功能

在體轉(zhuǎn)染Twist1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后皮質(zhì)組織細(xì)胞可以表達(dá)GFP（圖3A），基因原位雜交也可以檢測(cè)到Twist1過(guò)表達(dá)（圖3B）。免疫熒光分析結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，過(guò)表達(dá)Twist1后分布于室管膜區(qū)神經(jīng)祖細(xì)胞區(qū)GFP陽(yáng)性細(xì)胞減少約18%（P＜0.01），中間前體細(xì)胞區(qū)GFP陽(yáng)性細(xì)胞增多約15%（P＜0.05）（圖3C－E）。

3 討論

基因表達(dá)調(diào)控是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，比如神經(jīng)祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Pax6、Tbr2和Tbr1的依次表達(dá)，調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元分化［8］。Twist1作為轉(zhuǎn)錄因子，參與到多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

圖1 Twist1在皮質(zhì)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)Fig1 Expression of Twist1 at different developmental stages（×100）

實(shí)驗(yàn)利用Twist1編碼區(qū)反向互補(bǔ)序列為探針檢測(cè)Twist1在大腦皮質(zhì)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，探針的長(zhǎng)度覆蓋了基因的全長(zhǎng)，可以保證更好的特異性，過(guò)表達(dá)基因以后原位雜交顯示出的信號(hào)，也證明了反向互補(bǔ)序列探針是特異的。原位雜交顯示Twist1表達(dá)于大腦皮質(zhì)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，并且在神經(jīng)祖細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較高，提示其可能在祖細(xì)胞中發(fā)揮一定的功能。在體過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)Twist1以后室管膜區(qū)的祖細(xì)胞更多分化為中間前體細(xì)胞，并遷移出室管膜區(qū)。這一現(xiàn)象與早期研究中發(fā)現(xiàn)的Twist1促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相符［9］。

圖2 Twsit1在HEK-293ET細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)檢測(cè)Fig 2 Overexpression of Twist1 in HEK-293ET cell line（×200）

Twist1最初在發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，后期研究表明在腫瘤發(fā)生過(guò)程中也有著重要的作用，而Twist1與Wnt信號(hào)通路、BMP信號(hào)通路等都有緊密的聯(lián)系。本研究從Twist1基因的表達(dá)譜出發(fā)，對(duì)Twist1在皮質(zhì)發(fā)育中的功能進(jìn)行了初步的探討，為其調(diào)控通路的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)，也提示神經(jīng)發(fā)育與神經(jīng)腫瘤發(fā)生在研究上的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供了新的思路。

圖3 Twsit1在神經(jīng)祖細(xì)胞分化過(guò)程中的功能Fig 3 In vivo function of Twist1 in neural progenitor cells（×200）

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