FGFR2異構(gòu)體及相關(guān)剪接因子在人胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞中的表達(dá)

傅 歆，谷聰敏，嚴(yán) 笠，肖 苒

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心，北京 100144）

根據(jù)發(fā)育的不同階段，干細(xì)胞可以分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）和成體干細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）兩大類。體外懸浮培養(yǎng)的人ESCs可模擬體內(nèi)早期胚胎發(fā)育過(guò)程，分化形成含有三胚層來(lái)源細(xì)胞的擬胚體（embryoid Bodies，EBs）。中胚層來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs）以及外胚層來(lái)源的毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs）均屬于 ASCs。來(lái)源于不同發(fā)育階段和不同組織器官的干細(xì)胞在基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳狀態(tài)、體外增殖和分化潛能等方面都存在很大的差異［1］。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2）有兩個(gè)異構(gòu)體Ⅲb和Ⅲc，它們?cè)谏矬w個(gè)體發(fā)育過(guò)程發(fā)揮重要的調(diào)控作用。FGFR2Ⅲb與皮膚的發(fā)育有關(guān)，其缺失對(duì)小鼠具有致死性［2］;FGFR2Ⅲc的缺失會(huì)引起骨骼發(fā)育異常［3］?，F(xiàn)階段，F(xiàn)GFR2異構(gòu)體在胚胎發(fā)育不同階段的干細(xì)胞中的表達(dá)水平尚不明確。本實(shí)驗(yàn)比較了人H9 ESCs及其分化的EBs，以及BMSCs、ADSCs和HFSCs中FGFR2異構(gòu)體及其相關(guān)選擇性剪接因子的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細(xì)胞

高糖DMEM、PBS和雙抗（HyClone公司）;H9 ESC和HFSC細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑（Gibco和StemCell公司）;Matrigel（BD公司）;如無(wú)特殊說(shuō)明，化學(xué)藥品（Sigma公司）;引物合成（北京賽百盛公司）;RTPCR和Real-time PCR試劑（Invitrogen和Roche公司）;一抗 OCT4（sc-8629）、CK15（sc-56520）、P63（sc-25268）、CD29（sc-13590）（Santa Cruz公司）;一抗 SSEA-4（560073）、Tra-1-60（560071）、StemflowTM人MSC分析試劑盒（BD公司）;二抗（A21203和A11001）（Invitrogen公司）。

H9 ESC（WiCell公司）（同意書編號(hào):11-W0039）。ADSC來(lái)源于接受抽脂術(shù)的健康人（青年女性）脂肪組織。BMSC來(lái)源于健康志愿者（青年男性）髂骨骨髓。HFSC來(lái)源于美容除皺術(shù)切下的正常人帶毛發(fā)頭皮（均知情同意）。

1.2 H9 ESC的培養(yǎng)和EB分化

H9 ESC在Matrigel上的培養(yǎng)及EB分化方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［4］。

1.3 免疫熒光染色

細(xì)胞經(jīng)甲醛固定后破膜液（0.2%Tween-20/PBS）37℃處理15 min，一抗4℃過(guò)夜，二抗室溫避光3 h，Dapi染細(xì)胞核1 min，熒光顯微鏡采集圖像。

1.4 流式細(xì)胞鑒定BMSC和ADSC表面標(biāo)志物

取第3代BMSC和ADSC，按StemflowTM試劑盒說(shuō)明書標(biāo)記表面標(biāo)志物。樣本用FACSAriaTMⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

Trizol裂解細(xì)胞提取總RNA，取1 μg總RNA用于RT-PCR和Real-time PCR檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 干細(xì)胞培養(yǎng)及其生物學(xué)特性鑒定

在Matrigel上，H9 ESCs細(xì)胞克隆邊界光滑，結(jié)構(gòu)致密（圖1A）;高表達(dá) OCT4、SSEA-4和 Tra-1-60（圖1B，C，D）。H9 ESC懸浮培養(yǎng)后可形成EBs（圖1E，F(xiàn)）。EB分化過(guò)程中 ESC標(biāo)志物（OCT4，Nanog）mRNA表達(dá)逐漸較低，三胚層標(biāo)志物（NeuroD1、Brachyury、AFP）表達(dá)逐步升高（圖1G）。

BMSCs和ADSCs呈梭形平鋪生長(zhǎng)（圖2A），表達(dá)CD90、CD73、CD105;不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD116、CD19、CD45 和 HLA-DR（Neg Cocktail）（圖2B）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

圖1 H9 ESCs和EBs的生物學(xué)特性檢測(cè)Fig 1 Characterizations of H9 ESCs and EBs

圖2 BMSC、ADSC和HFSC的生物學(xué)特性檢測(cè)Fig 2 Characterizations of BMSC，ADSC and HFSC（±s，n=3）

HFSCs呈多角形鋪路石狀（圖2C），表達(dá)CK15、CD29和P63（圖2D）。上皮細(xì)胞標(biāo)志基因E-cadherin在HFSCs中的表達(dá)水平顯著高于在BMSC和ADSC中（P＜0.001），而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因N-cadherin、twist和vimentin在 BMSCs和ADSCs中的表達(dá)水平顯著高于在HFSCs中（P＜0.001）（圖2E）。

2.2 FGFR2異構(gòu)體及相關(guān)剪接因子在H9 ESCs和EBs中的表達(dá)

FGFR2選擇性剪接在H9 ESCs及EBs中均以Ⅲc為主。H9 ESCs向EB分化后，Ⅲb和Ⅲc的表達(dá)水平及Ⅲb/Ⅲc的比值均顯著升高（P＜0.05）（圖3A）。抑制Ⅲb表達(dá)的HnRNPA1在EB分化第14天顯著上升，而抑制Ⅲc表達(dá)的FOX2在EB分化第7天后即顯著上升（P＜0.05）（圖3B，3C，3D）。

2.3 FGFR2異構(gòu)體及相關(guān)剪接因子在不同組織來(lái)源ASCs中的表達(dá)

FGFR2異構(gòu)體在BMSCs、ADSCs和HFSCs中的表達(dá)均以Ⅲc為主，但均顯著低于H9 ESCs（P＜0.05）;在ASCs中的表達(dá)水平由高至低依次為HFSCs、BMSCs和 ADSCs（P ＜0.05）（圖 4A）。HFSCs中FGFR2相關(guān)剪接因子的表達(dá)與H9 ESCs類似，并高于 BMSCs和 ADSCs（圖 4B，4C，4D）。

3 討論

了解不同發(fā)育階段和組織來(lái)源的干細(xì)胞中FGFR2異構(gòu)體及其選擇性剪接因子的表達(dá)，有利于探索FGFR2及其相關(guān)信號(hào)通路在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的功能和機(jī)制，為與之相關(guān)疾病的診療提供理論基礎(chǔ)。

圖3 FGFR2異構(gòu)體及其剪接因子在H9 ESCs和EBs中的表達(dá)Fig 3 Expression of FGFR2 isoforms and relevant splicing factors in H9 ESCs and EBs（±s，n=3）

本研究發(fā)現(xiàn)，H9 ESC向EB分化過(guò)程中，F(xiàn)GFR2Ⅲb和Ⅲc的表達(dá)水平均顯著升高，且Ⅲb/Ⅲc比值升高;提示在胚胎發(fā)育早期，F(xiàn)GFR2表達(dá)水平升高，且FGFR2選擇性剪接方式發(fā)生改變。EB分化過(guò)程中FOX2在第7天顯著提高而HnRNPA1在EB分化的第14天才升高，這可能是EB分化早期Ⅲb/Ⅲc比值升高的原因。

與H9 ESCs一致，F(xiàn)GFR2異構(gòu)體在3種ASCs的剪接方式均以Ⅲc為主，且在H9 ESCs與HFSCs中的表達(dá)水平顯著高于在間充質(zhì)干細(xì)胞中。已有研究顯示FGFR2Ⅲc與FGF1、FGF2、FGF4和FGF8的親和力較高［5-6］。FGF2是ESC體外培養(yǎng)中至關(guān)重要的生長(zhǎng)因子，對(duì)維持ESC的自我更新和未分化狀態(tài)起著至關(guān)重要的作用［7-8］。因此，H9 ESCs中高表達(dá)FGFR2Ⅲc與其生物學(xué)特性在體外的維持有關(guān)。此外，ADSC中 FGFR2表達(dá)水平顯著低于BMSC中，提示FGFR2異構(gòu)體在不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)水平存在差異，這可能與不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性有關(guān)。

同F(xiàn)GFR2表達(dá)結(jié)果一致，H9 ESCs和HFSC中多種FGFR2相關(guān)剪接因子的表達(dá)水平顯著高于間充質(zhì)干細(xì)胞中。H9 ESC高表達(dá)多種FGFR2剪接因子可能與其具有的三胚層分化潛能有關(guān)。有研究顯示，HFSC除了參與毛發(fā)周期性的自我更新和生長(zhǎng)，在皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，HFSC還可增殖并遷移到創(chuàng)傷部位形成新的表皮細(xì)胞促進(jìn)傷口愈合［9］。因此，HFSC高表達(dá)多種FGFR2剪接因子可能與其周期性自我更新與遷移能力有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

圖4 FGFR2異構(gòu)體及相關(guān)剪接因子在ASCs中的表達(dá)Fig 4 Expression of FGFR2 isoforms and the relevant splicing factors in ASCs（±s，n=3）

［1］金穎.多能干細(xì)胞研究進(jìn)展［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31:597-601.

［2］Petiot A，Conti FJ，Grose R，et al.A crucial role for Fgfr2-Ⅲb signalling in epidermal development and hair follicle patterning［J］.2003，130:5493-5501.

［3］ Eswarakumar VP，Monsonego-Ornan E，Pines M，et al.TheⅢc alternative of fgfr2 is a positive regulator of bone formation ［J］.Development，2000，129:3783-3793.

［4］Fu X，Toh WS，Liu H，et al.Autologous feeder cells from embryoid body outgrowth support the long-term growth of human embryonic stem cells more effectively than those from direct differentiation ［J］.Tissue Eng，2010，16:719-733.

［5］Dell KR，Williams LT.A novel form of fibroblast growth factor receptor 2 Alternative splicing of the third immunoglobulin-like domain confers ligand binding specificity［J］.J Biol Chem，1992，26:21225-21229.

［6］ Jognson LB.Physiology of the gastrointestinal tract.4th［M］//MA:Elsevier Academic Press，2006:216-217.

［7］Levenstein ME，Ludwig TE，Xu RH，et al.Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal［J］.Stem Cells，2006，24:568-574.

［8］Amit M，Carpenter MK，Inokuma MS，et al.Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture［J］.Dev Biol，2000，227:271-278.

［9］ Taylor G，Lehrer MS，Jensen PJ，et al.Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis［J］.Cell，2000，102:541-561.