巨噬細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞株侵襲能力的影響

李 焱,陳 石,魏 東,程 朋,彭晶晶,趙振國(guó),譚 勇

巨噬細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞,通過(guò)直接吞噬或抗原呈遞來(lái)參與機(jī)體免疫反應(yīng)。既往研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞可通過(guò)直接殺傷腫瘤細(xì)胞,或通過(guò)呈遞腫瘤相關(guān)抗原誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答來(lái)清除腫瘤細(xì)胞。同時(shí)另有一些研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的相互作用,揭示巨噬細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響,并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細(xì)胞株SMMC7721及人單核/巨噬細(xì)胞株THP-1均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(FBS)、細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640、DMEM、胰蛋白酶、Hank平衡液為GIBCO公司產(chǎn)品；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)為Sigma公司產(chǎn)品；Transwell遷移小室、Matrigel基質(zhì)膠為BD公司產(chǎn)品；MMP-9 ELISA試劑盒為R&D公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分化誘導(dǎo) 將THP-1細(xì)胞株接種于含有150 ml/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中,待細(xì)胞增殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集,以1×109個(gè)/L接種于培養(yǎng)瓶中,加入200 nmol/L的PMA作用24 h。

1.2.2活化的巨噬細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立 參考章必成等[2]方法,選擇遷移小室和24孔培養(yǎng)板建立Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)。首先在下室內(nèi)接種含1×104個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC7721細(xì)胞,4 h后實(shí)驗(yàn)組在上室內(nèi)接種活化的THP-1細(xì)胞(1×104個(gè)),然后共培養(yǎng)。根據(jù)上室內(nèi)的細(xì)胞類型分為對(duì)照組(未接種任何細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)組(接種活化的THP-1細(xì)胞)。

1.2.3Transwell侵襲模型檢測(cè)肝癌細(xì)胞侵襲能力 將侵襲小室放入滅菌的24孔板中,其中侵襲小室內(nèi)鋪Matrigel基質(zhì)膠。培養(yǎng)板中分別加入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)液上清各1 ml。將1×104個(gè)肝癌細(xì)胞接種于遷移小室中,孵育箱中培育24 h后取出,用棉簽擦去內(nèi)表面的基質(zhì)膠和細(xì)胞。將其置入95%乙醇中固定10 min,行HE染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)膜背面的細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)5個(gè)視野,取平均值進(jìn)行比較。

1.2.4MMP-9檢測(cè) MMP-9檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)液各12份,與稀釋液混合,孵育2 h,緩沖液清洗,依次加入結(jié)合物、底物、終止液,用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1兩組肝癌細(xì)胞侵襲能力的比較 在細(xì)胞培養(yǎng)基趨化作用下,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為40.2±7.1和61.2±13.8,對(duì)照組顯著多于實(shí)驗(yàn)組(t=3.022,P=0.017)。

2.2兩組MMP-9水平的比較 兩組培養(yǎng)體系中,MMP-9水平分別是,實(shí)驗(yàn)組(353.58±55.07)ng/ml,對(duì)照組(308.37±34.48)ng/ml,實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(t=2.411,P=0.025)。

3 討論

腫瘤與炎癥的聯(lián)系已被流行病學(xué)調(diào)查所證實(shí),一方面慢性炎癥可以誘發(fā)腫瘤,與炎癥相關(guān)的腫瘤約占15%左右[3],肝癌就是其中的典型。另一方面腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量的炎癥因子,在腫瘤局部微環(huán)境中產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng),諸如促進(jìn)血管、淋巴管生成；抑制局部免疫反應(yīng)和免疫監(jiān)視,形成免疫逃逸；破壞細(xì)胞基質(zhì),促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移等等。而腫瘤局部微環(huán)境中的炎癥因子可趨化大量的巨噬細(xì)胞聚集。Takanami等[4]研究113例肺腺癌患者手術(shù)標(biāo)本中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的密度,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞是獨(dú)立的預(yù)后因素,高密度巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的患者預(yù)后較差。

細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要屏障,基質(zhì)的降解與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。金屬基質(zhì)蛋白酶是目前發(fā)現(xiàn)的參與基質(zhì)降解的主要因子[5]。在肝癌相關(guān)研究中有報(bào)道,腫瘤基質(zhì)中金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)水平是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因素之一[6]。

巨噬細(xì)胞可分泌包括金屬蛋白酶在內(nèi)的多種基質(zhì)水解酶,還可分泌一些因子作為金屬基質(zhì)蛋白酶的活化劑,參與細(xì)胞外基質(zhì)的破壞。Hagemann等[7]報(bào)道,將巨噬細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)后,可上調(diào)腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)。Hiraoka等[8]在使用特異性巨噬細(xì)胞清除劑后,明顯抑制了肺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。研究者分析原因,認(rèn)為巨噬細(xì)胞在腫瘤局部的趨化因子的誘導(dǎo)下,進(jìn)入腫瘤組織并分泌多種基質(zhì)水解酶；同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的分解產(chǎn)物又與腫瘤細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體結(jié)合,逆向激活一系列活性細(xì)胞因子的表達(dá)(含金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá))[9-10]。本研究通過(guò)模擬腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用,也看到了類似現(xiàn)象,在腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的體系中,腫瘤細(xì)胞的侵襲能力得到增強(qiáng),并且與金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)增高有關(guān)。

因此,更深入地研究巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制,并將這些機(jī)制應(yīng)用于巨噬細(xì)胞在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的研究,將為腫瘤的治療提供新的方法。

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