胰島移植：尋找新的β細(xì)胞來(lái)源

穆 冰，宋一民，李曉斌，趙玉沛

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院基本外科， 北京 100730

·綜 述·

胰島移植：尋找新的β細(xì)胞來(lái)源

穆 冰，宋一民，李曉斌，趙玉沛

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院基本外科， 北京 100730

胰島移植；胰島干細(xì)胞；1型糖尿病

胰島移植被認(rèn)為是1型糖尿病最有前景的治療方法之一。若以生活質(zhì)量改善及血糖控制為目標(biāo)，胰島移植的效果令人滿意；但若以脫離外源胰島素或預(yù)防并發(fā)癥為目標(biāo)，則前者差強(qiáng)人意，后者效果不明[1]。為此，美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)仍將胰島移植定為實(shí)驗(yàn)階段，距離臨床應(yīng)用尚有距離[2]。

胰島移植及面臨的問(wèn)題

胰島移植最早可以追溯至1972年的大鼠實(shí)驗(yàn)[3]，此后逐漸開(kāi)展，但成功率很低。一項(xiàng)對(duì)1990年至1999年共267例胰島移植患者的隨訪表明，僅<10%的患者脫離外源胰島素時(shí)間超過(guò)1年[4]。2000年，Shapiro等[5]報(bào)道采用改良移植技術(shù)及術(shù)后抗免疫排斥藥物治療，結(jié)果7例患者在為期一年的隨訪中全部脫離了外源胰島素，這種被稱(chēng)為Edmonton方案的移植流程逐漸被世界上多數(shù)研究中心采納。2006年一項(xiàng)多中心試驗(yàn)表明，采用Edmonton方案移植的患者70%移植兩年后胰島仍具有分泌功能，但完全脫離外源胰島素治療患者在移植一年及兩年后分別僅44%和14%的胰島有分泌功能[6]。另一項(xiàng)多中心研究統(tǒng)計(jì)了1999年至2007年共279例胰島移植患者，移植3年后23%～26%的患者仍具有有分泌功能的胰島，但脫離外源胰島素的患者比例從移植后一年的47%下降至24%[7]。隨著Edmonton方案的進(jìn)一步推行， 2012年美國(guó)CITR(Collaborative Islet Transplant Registry)公布了1999年至2010年共677例胰島移植統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示2007年至2010年進(jìn)行的208例胰島移植的效果明顯優(yōu)于前期(1999年至2002年、2003年至2006年)，3年脫離外源胰島素率為44%(前期分別僅為27%、37%)，不良事件發(fā)生率也較前期減少[8]。

Edmonton方案通過(guò)提高移植量和運(yùn)用抗免疫排斥藥物改善胰島移植效果，但仍不夠理想，分析原因在于移植量受限和移植后有效期短；此外，費(fèi)用昂貴、遠(yuǎn)期效果尚不明確也是其走向臨床的障礙。

胰島移植需要大量胰島當(dāng)量(islet equivalents, IEQ)。影響胰島細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的原因，一方面來(lái)自于供體的健康狀態(tài)、對(duì)胰腺的處理和運(yùn)輸、胰島分離等步驟[9]；另一方面由于1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，自體移植的胰島細(xì)胞會(huì)受到免疫系統(tǒng)攻擊導(dǎo)致數(shù)量減少。目前進(jìn)行胰島移植的主要部位仍為經(jīng)門(mén)靜脈肝內(nèi)移植，預(yù)計(jì)在過(guò)去10年中有750例1型糖尿病患者接受了這類(lèi)移植[10]，僅有少部分患者接受了胰島腎包膜下移植。異體移植雖然可避免自身免疫反應(yīng)，但隨之而來(lái)的免疫排斥作用也會(huì)引起移植細(xì)胞凋亡。

隨著免疫抑制藥物的發(fā)展，異體胰島細(xì)胞成為胰島移植的主要研究方向?；铙w移植、異種移植以及細(xì)胞工程都曾被作為可能的胰島細(xì)胞來(lái)源。活體供者較死亡供者可以分離得到數(shù)量更多、質(zhì)量更好的胰島[11]，但活體供者除了要承擔(dān)手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)外，還面臨著日后發(fā)展為糖尿病的可能[12]，故不宜開(kāi)展。1994年瑞典開(kāi)展了首個(gè)豬胰島異種移植試驗(yàn)[13]，在隨后4～7年的隨訪中雖然受試者仍需胰島素治療，但移植耐受良好，無(wú)豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus， PERV)感染跡象[14]。隨后俄羅斯、墨西哥也開(kāi)展了臨床試驗(yàn)，但很快遭到國(guó)際異種移植協(xié)會(huì)反對(duì)，對(duì)其倫理問(wèn)題和安全性提出質(zhì)疑[15]。

細(xì)胞工程為解決胰島細(xì)胞來(lái)源帶來(lái)了新的曙光。β細(xì)胞永生化修飾是通過(guò)將外源基因引入人胰島β細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖并阻止細(xì)胞凋亡，但攜帶外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒會(huì)整合入宿主DNA，致癌風(fēng)險(xiǎn)不容忽視，此外轉(zhuǎn)基因表達(dá)還會(huì)影響β細(xì)胞對(duì)糖刺激的反應(yīng)[16- 17]。在體外增殖至所需胰島細(xì)胞數(shù)量后剔除轉(zhuǎn)基因再行移植是理想的解決途徑，但如何驗(yàn)證其安全性仍是難題。

胰島干細(xì)胞移植

干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化是解決胰島來(lái)源短缺的另一途徑。目前已在體外誘導(dǎo)成功的干細(xì)胞包括人胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以及肝干細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞等。

人胚胎干細(xì)胞

對(duì)人胚胎干細(xì)胞的研究表明將體外誘導(dǎo)6～9周的干細(xì)胞植入動(dòng)物模型進(jìn)一步分化可得到對(duì)血糖波動(dòng)具有應(yīng)答的胰島素分泌細(xì)胞[18]，而在體外誘導(dǎo)至最終狀態(tài)的細(xì)胞則不具有對(duì)血糖波動(dòng)的應(yīng)答[19]，原因可能在于體內(nèi)胰島細(xì)胞微環(huán)境對(duì)于分化至關(guān)重要[20]。人胚胎干細(xì)胞雖然被成功分化且來(lái)源廣泛，但其所涉及的倫理問(wèn)題尚未解決，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可致畸胎瘤，考慮到移植患者需長(zhǎng)期服用免疫抑制藥物，胚胎干細(xì)胞的安全性在開(kāi)展人體試驗(yàn)前還需進(jìn)一步研究[21]。

間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞及羊水干細(xì)胞等多種間充質(zhì)干細(xì)胞已在體外成功分化為具有應(yīng)答能力的胰島素分泌細(xì)胞[22]，并且間充質(zhì)干細(xì)胞本身即具有免疫調(diào)節(jié)功能和抗炎作用，通過(guò)抑制T細(xì)胞控制自身免疫反應(yīng)，達(dá)到對(duì)β細(xì)胞的保護(hù)作用[23]。糖尿病鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)將體外分化得到的胰島素分泌細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)后血糖下降了50%[24]；另一項(xiàng)鼠模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了自體間充質(zhì)干細(xì)胞移植，移植后小鼠血糖水平得到了更好的控制[25]。Osiris公司近期發(fā)布的一項(xiàng)針對(duì)同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療1型糖尿病有效性及安全性Ⅱ期臨床研究中期報(bào)告顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的安全性和耐受性，可減少受試者低血糖事件發(fā)生，但對(duì)內(nèi)源胰島素分泌量作用不明顯(ClinicalTrials.gov， 臨床試驗(yàn)注冊(cè)號(hào)：NCT00690066)。此外，對(duì)于糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，如糖尿病腎病[26- 27]、視網(wǎng)膜病變[28]等，甚至在促進(jìn)糖尿病患者傷口愈合方面[29- 30]，間充質(zhì)干細(xì)胞都被證實(shí)具有一定效果。間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用目前仍存在很多問(wèn)題，在鼠模型實(shí)驗(yàn)中曾發(fā)現(xiàn)移植鼠體內(nèi)出現(xiàn)腫塊，組織病理學(xué)證實(shí)惡性征象[24]。提示將間充質(zhì)干細(xì)胞用于人體試驗(yàn)，還需進(jìn)行有效性及安全性的進(jìn)一步測(cè)試。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)最早于2006年由2位日本科學(xué)家報(bào)道[31]。2010年Alipio等[32]在體外將iPSCs誘導(dǎo)為可對(duì)血糖波動(dòng)產(chǎn)生應(yīng)答的胰島素分泌細(xì)胞，并將這種細(xì)胞移植到1型和2型糖尿病小鼠模型中，結(jié)果成功糾正了模型鼠的高血糖狀態(tài)。制備iPSCs最早的技術(shù)涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，由此帶來(lái)的安全性問(wèn)題備受質(zhì)疑。2008年一種新的制備技術(shù)出現(xiàn)，通過(guò)腺病毒載體將外源基因轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞中高效表達(dá)，同時(shí)不整合入宿主細(xì)胞基因組，從而避免了腫瘤形成的危險(xiǎn)性[33]。另一種新的制備技術(shù)也隨后出現(xiàn)，不通過(guò)引入任何外源基因，利用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子將人精原干細(xì)胞重新誘導(dǎo)分化成多能干細(xì)胞[34]。除了誘導(dǎo)分化成胰島β樣細(xì)胞，另一項(xiàng)具有創(chuàng)造性的報(bào)道同樣來(lái)自日本科學(xué)家。Kobayashi等[35]向胰腺缺陷小鼠囊胚中注射正常大鼠來(lái)源的多能干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)育出由大鼠細(xì)胞構(gòu)成的胰腺；他們希望能夠通過(guò)這種方式在豬體內(nèi)培育出人胰腺組織，經(jīng)過(guò)分離純化用于人胰島移植。

肝干細(xì)胞

另一種備受關(guān)注的成體干細(xì)胞是肝干細(xì)胞。肝臟與胰腺具有共同的內(nèi)胚層來(lái)源，通過(guò)活檢可以輕易取到肝組織，并且肝臟再生迅速，細(xì)胞來(lái)源廣泛。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)腺病毒載體向?qū)嶒?yàn)鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)入Pdx- 1基因可引起一系列胰腺內(nèi)外分泌相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)在肝組織中有胰腺細(xì)胞生成，這些細(xì)胞可維持糖尿病鼠血糖8個(gè)月內(nèi)正常[36]。高血糖狀態(tài)可能在這種誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[37]。但目前肝干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)僅在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得成功，體外實(shí)驗(yàn)肝干細(xì)胞難以擴(kuò)增至移植需要量，如何保證體內(nèi)誘導(dǎo)的安全性以及體外擴(kuò)增是肝干細(xì)胞研究面臨的主要問(wèn)題。

胰腺干細(xì)胞及其他類(lèi)型細(xì)胞

胰腺其他類(lèi)型細(xì)胞也是β細(xì)胞的潛在來(lái)源之一。胰腺外分泌細(xì)胞及胰島α細(xì)胞均被成功誘導(dǎo)分化成β細(xì)胞[38- 39]，胰腺干細(xì)胞研究則略有爭(zhēng)議。一方面，的確發(fā)現(xiàn)胰腺中存在極少量的干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為β細(xì)胞[40]；另一方面，在肥胖、妊娠患者及胰腺切除小鼠中發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞增殖主要靠已有的β細(xì)胞有絲分裂完成[41]，2011年Furuyama等[42]采用細(xì)胞系標(biāo)記方法發(fā)現(xiàn)人胰腺導(dǎo)管細(xì)胞與胰腺祖細(xì)胞均表達(dá)Sox- 9，而胰島細(xì)胞不表達(dá)，進(jìn)而推測(cè)在發(fā)育早期胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞即從上皮系中分離出來(lái)，為胰島細(xì)胞通過(guò)自我復(fù)制達(dá)到增殖提供了新的證據(jù)。如何獲取這些罕有的干細(xì)胞并且在體外誘導(dǎo)增殖，以及如何使胰島β細(xì)胞在體外進(jìn)行有效增殖，是當(dāng)前研究的主要問(wèn)題。

結(jié) 論

細(xì)胞來(lái)源短缺是胰島移植面臨的主要難題之一。細(xì)胞工程技術(shù)，特別是干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為解決這一問(wèn)題帶來(lái)了新的曙光。多種干細(xì)胞已經(jīng)成功地在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)試驗(yàn)中被證實(shí)可誘導(dǎo)成為具有生理功能的胰島素分泌細(xì)胞，但這些細(xì)胞是否為真正的β細(xì)胞，其安全性及誘導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)等還需進(jìn)一步驗(yàn)證和改良。

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趙玉沛 電話：010-69155818， E-mail：zhao8028@263.net

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A

1674-9081(2014)03-0335-04

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.03.018

2013- 07- 26)