樟子松樹皮多酚螯合亞鐵制備工藝

劉 榮，王 蕾，欒淑瑩，姜元松，王振宇

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090)

傳統(tǒng)的礦物質(zhì)產(chǎn)品，往往由于其分子量較大而不能通過腸壁，因而不能為人體所吸收利用;而如硫酸亞鐵等傳統(tǒng)的小分子化合物由于其在胃酸消化過程中，亞鐵離子與載體分離變?yōu)樽杂苫笕菀妆谎趸?，從而也?huì)降低其生物效價(jià)。多酚螯合亞鐵同氨基酸螯合亞鐵類似具有極高的生物效價(jià)，由于其分子量相對(duì)較小，因而能夠輕松通過腸壁被人體所吸收。并且多酚螯合亞鐵不隨著外界環(huán)境pH的變化而改變，即使在胃部消化較低pH條件下依然能穩(wěn)定存在不分解，因此，能夠隨著血漿順利地進(jìn)入人體各個(gè)組織，最終在不同組織酶的作用下最終分解釋放原子耦合劑到更穩(wěn)定的運(yùn)鐵蛋白中，被人體所利用。筆者通過水體系合成法研究建立了樟子松樹皮多酚與亞鐵離子螯合的工藝，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化了螯合工藝方法，得到了螯合率較高的環(huán)狀螯合物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，旨在提升松多酚以及亞鐵離子的生物效價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑。無水碳酸鈉、福林酚試劑，均為分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;濃鹽酸，標(biāo)品級(jí)，Sigma公司;氫氧化鈉、無水乙醇、抗壞血酸、氯化亞鐵、還原鐵粉，均為分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;溴化鉀，光譜純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備。DK-8D三孔電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司;JA2003電子天平，上海良平儀器儀表有限公司;PB-10 pH計(jì)，SARTORIUS AG Made by Sartorious;DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司;T6紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;722可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;TGL-16G低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;Nicolet Avatar360紅外光譜儀，美國Nicolet公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的制備。稱取一定質(zhì)量的樟子松樹皮粉末，以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇為作為溶劑，按料液比1∶25 g/ml進(jìn)行水浴浸提，水浴溫度為50℃，浸提時(shí)間4 h，將浸提液在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下高速離心20 min后減壓濃縮蒸去乙醇，得到多酚粗提物;將上述粗提物在上樣體積30 ml，上樣濃度3 mg/ml，洗脫劑乙醇濃度為53%條件下進(jìn)行一次純化，控制進(jìn)樣速度以及洗脫速度分別為5.0 BV/h以及4.5 BV/h;收集純化物，減壓濃縮蒸去乙醇，得到樟子松樹皮多酚一級(jí)純化產(chǎn)物。將上述得到一級(jí)純化物在上樣濃度為4.3 mg/ml，上樣體積為60.7 ml，徑高比為1∶30.6的條件下進(jìn)行二次純化，控制洗脫流速為2.0 BV/h;收集純化物，減壓濃縮蒸去乙醇，得到樟子松樹皮多酚二級(jí)純化產(chǎn)物，備用。

1.2.2 Folin-Ciocalteu法測定多酚含量。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱取0.100 g干燥的沒食子酸用蒸餾水溶解并定容于100 ml容量瓶中，配置成1 000 μg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;同時(shí)分別移取等體積的1.0～7.0 ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 ml容量瓶中并定容，配置成濃度分別為 10、20、30、40、50、60、70 μg/ml的工作液。在10 ml棕色容量瓶中分別移取不同濃度的工作液1 ml，各加入體積分?jǐn)?shù)10%福林酚試劑5 ml后充分振蕩搖勻，反應(yīng)5 min加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的碳酸鈉溶液4 ml并通過蒸餾水定容;置于25℃恒溫水浴條件下反應(yīng)1 h，以蒸餾水為空白對(duì)照于765 nm波長下測定混合體系吸光值［1］。

將橫坐標(biāo)定為沒食子酸質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)定為765 nm波長下混合體系吸光值，最終繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品含量的測定。在10 ml棕色容量瓶中加入樣液1 ml，加入體積分?jǐn)?shù)10%福林酚試劑5 ml后充分振蕩搖勻，反應(yīng)5 min加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的碳酸鈉溶液4 ml并通過蒸餾水定容;置于25℃恒溫水浴條件下反應(yīng)1 h，以蒸餾水為空白對(duì)照于765 nm波長下測定混合體系吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量。純度公式:

P(%)=［(C×V)/W］×100%

式中，C為復(fù)溶后多酚的濃度(mg/ml);V為復(fù)溶時(shí)定容的體積(ml);W為烘干后的干物質(zhì)重(mg)。

1.2.3 松多酚螯合亞鐵制備工藝的研究。

1.2.3.1 松多酚螯合亞鐵制備工藝流程。量取一定體積的濃度為1 mg/ml的樟子松樹皮多酚二級(jí)純化物溶液于具塞試管，用1 mol/L氫氧化鈉溶液以及1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)所需pH，按照一定質(zhì)量比加入一定體積的1 mg/ml的氯化亞鐵溶液，并向體系中按照氯化亞鐵質(zhì)量的1/10加入復(fù)合抗氧化劑(還原鐵粉以及抗壞血酸)［2］，封口后放入水浴條件下按照一定溫度反應(yīng)1 h，將所得溶液取出在10 000 r/min條件下離心分離除去沉淀，收集上清液并按照公式計(jì)算亞鐵離子螯合率。

1.2.3.2 pH對(duì)多酚螯合亞鐵螯合效果的影響。量取7份濃度為1 mg/ml的樟子松樹皮多酚二級(jí)純化物溶液，每份各10 ml置于具塞試管中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液以及1 mol/L鹽酸溶液將多酚溶液 pH 分別調(diào)節(jié)為 3、4、5、6、7、8、9，并按照質(zhì)量比為2∶1加入濃度為1 mg/ml的氯化亞鐵溶液，并向體系中按照加入氯化亞鐵質(zhì)量的1/10加入復(fù)合抗氧化劑(還原鐵粉以及抗壞血酸)，封口后放入50℃水浴條件下反應(yīng)1 h，將所得溶液取出在10 000 r/min條件下離心分離除去沉淀，收集上清液測定游離多酚含量，并按照公式計(jì)算亞鐵離子螯合率。確定pH對(duì)多酚螯合亞鐵螯合效果的影響，并確定最適宜螯合pH。

1.2.3.3 松多酚與亞鐵離子質(zhì)量比對(duì)多酚螯合亞鐵螯合效果的影響。量取7份濃度為1 mg/ml的樟子松樹皮多酚二級(jí)純化物溶液，每份各10 ml置于具塞試管中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液以及1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)多酚溶液pH為7，并分別按照質(zhì)量比為 1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1加入濃度為1 mg/ml的氯化亞鐵溶液，并向體系中按照加入氯化亞鐵質(zhì)量的1/10加入復(fù)合抗氧化劑(還原鐵粉以及抗壞血酸)，封口后放入50℃水浴條件下反應(yīng)1 h，將所得溶液取出在10 000 r/min條件下離心分離除去沉淀，收集上清液測定游離多酚含量，并按照公式計(jì)算亞鐵離子螯合率。確定質(zhì)量比對(duì)多酚螯合亞鐵螯合效果的影響，并確定最適宜螯合質(zhì)量比。

1.2.3.4 反應(yīng)溫度對(duì)多酚螯合亞鐵螯合效果的影響。量取7份濃度為1 mg/ml的樟子松樹皮多酚二級(jí)純化物溶液，每份各10 ml置于具塞試管中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液以及1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)多酚溶液pH為7，按照質(zhì)量比為3∶1加入濃度為1 mg/ml的氯化亞鐵溶液，并向體系中按照加入氯化亞鐵質(zhì)量的1/10加入復(fù)合抗氧化劑(還原鐵粉以及抗壞血酸)，封口后分別放入 30、35、40、45、50、55、60 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h，將所得溶液取出在10 000 r/min條件下離心分離除去沉淀，收集上清液測定游離多酚含量，并按照公式計(jì)算亞鐵離子螯合率。確定反應(yīng)溫度對(duì)多酚螯合亞鐵螯合效果的影響，并確定最適宜螯合反應(yīng)溫度。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化松多酚螯合亞鐵制備工藝。根據(jù)樟子松多酚與亞鐵離子螯合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)螯合效果影響較大的3個(gè)因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以螯合率為響應(yīng)值，做3因素3水平共17組響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以研究所選的3個(gè)因素對(duì)樟子松多酚與金屬亞鐵離子螯合的綜合影響。

1.2.5 松多酚亞鐵離子螯合物紫外光譜法結(jié)構(gòu)分析。

1.2.5.1 松多酚亞鐵離子螯合物的制備。量取濃度為1 mg/ml的多酚二級(jí)純化物溶液60 ml于100 ml三角瓶中，用1 mol/L氫氧化鈉及1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)所需pH為7，按照質(zhì)量比3∶1加入20 ml的1 mg/ml的氯化亞鐵溶液，并向體系中按照加入氯化亞鐵質(zhì)量的1/10加入復(fù)合抗氧化劑(還原鐵粉以及抗壞血酸)，封口后放入水浴內(nèi)于45℃條件下反應(yīng)1 h，將所得溶液取出在10 000 r/min條件下離心分離洗滌收集沉淀，烘干待用。

1.2.5.2 紫外光譜分析。分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的松多酚螯合亞鐵以及松多酚甲醇溶液，采用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行200～700 nm全波長掃描，以甲醇為參比溶液測定松多酚及其亞鐵離子螯合物的光譜并繪制全波長掃描曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析 該研究所有進(jìn)行試驗(yàn)均平行3次，數(shù)據(jù)表示為:結(jié)果±標(biāo)準(zhǔn)差;圖像及圖表分析均采用Excel(2007)、Design-expert(7.0)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)“1.2.2.1”方法測得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.010 56x+0.009 9，其中橫坐標(biāo)x表示沒食子酸質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)y表示765 nm波長下的吸光值。在0～70 μg/ml的沒食子酸質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其吸光值大小與濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程按照“1.2.2.2”方法中純度計(jì)算公式計(jì)算，得樟子松樹皮多酚二級(jí)純化物純度為(62.06±1.67)%。

2.2 pH對(duì)多酚螯合亞鐵螯合率的影響 pH條件帶來的環(huán)境體系變化是影響金屬離子與多酚進(jìn)行螯合反應(yīng)的一個(gè)重要因素。在pH較低的強(qiáng)酸體系環(huán)境中，氫離子將與微量元素金屬離子共同爭奪供電基團(tuán)，嚴(yán)重影響鰲合物的形成;而在pH較高的強(qiáng)堿環(huán)境體系中，羥基會(huì)存在與供電基團(tuán)共同爭奪微量元素離子生成沉淀的可能性［3］。此外，植物多酚配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及金屬配體的構(gòu)型，甚至是加料順序以及有機(jī)抗衡離子特性，甚至是微小的反應(yīng)條件的改變，都會(huì)影響螯合物的螯合效果［4］。

由圖1可知，pH在3～7范圍內(nèi)，隨著pH的升高，亞鐵離子螯合率升高，當(dāng)pH=7時(shí)亞鐵離子螯合率達(dá)到最大，為(28.11±1.83)%，隨后開始逐漸降低，這是因?yàn)閜H升高意味著體系環(huán)境中羥基增加，游離的亞鐵離子與羥基結(jié)合形成氫氧化亞鐵的機(jī)會(huì)增加，不利于松多酚螯合亞鐵的生成和穩(wěn)定，且生成的副產(chǎn)物氧化亞鐵極易氧化，生成沉淀。同時(shí)，pH增大帶來的堿性環(huán)境會(huì)增加亞鐵離子氧化的機(jī)會(huì)，不利于亞鐵離子的穩(wěn)定存在。因此，考慮pH=7為螯合反應(yīng)最適宜pH。

圖1 pH對(duì)螯合率的影響

2.3 反應(yīng)質(zhì)量比對(duì)多酚螯合亞鐵螯合率的影響 不同微量元素金屬離子其配位數(shù)量也自然不同，鰲合物中微量元素金屬離子與植物多酚的摩爾比可以是 1∶1、1∶2、1∶3。事實(shí)證明，當(dāng)反應(yīng)體系為較低濃度時(shí)，微量元素與植物多酚易形成配位數(shù)為1∶1的鰲合物;當(dāng)濃度升高時(shí)可形成配位數(shù)為2∶1的鰲合物［5］。而通常情況下考慮植物多酚與金屬離子以1∶1的配位數(shù)形成螯合物時(shí)是具有一定電荷的，因此易被膠體吸附固定;而以2∶1的配位數(shù)形成的的內(nèi)絡(luò)鹽電荷趨于中性，螯合環(huán)最為穩(wěn)定。

當(dāng)多酚與金屬離子形成螯合物時(shí)，一個(gè)中心金屬離子可以和多個(gè)多酚類化合物形成螯合環(huán)，形成環(huán)數(shù)越多其化學(xué)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。反應(yīng)質(zhì)量比是影響金屬離子與多酚螯合反應(yīng)的因素之一。由圖2可知，隨著反應(yīng)物質(zhì)量比的增大，多酚與亞鐵離子螯合率先逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)質(zhì)量比為3∶1時(shí)，螯合率達(dá)到最大，為(37.74±2.66)%，這是因?yàn)榉磻?yīng)質(zhì)量比較小時(shí)，部分亞鐵離子未與多酚形成環(huán)狀螯合物，或形成的環(huán)狀螯合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，經(jīng)過離心操作，亞鐵離子可能再次游離出來;隨著反應(yīng)質(zhì)量比繼續(xù)增大，亞鐵離子螯合率出現(xiàn)逐漸降低，這可能是由于超過一定反應(yīng)質(zhì)量比，多酚與亞鐵離子形成的環(huán)狀螯合物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。此外，加入過量多酚顯然在經(jīng)濟(jì)上造成一定的浪費(fèi)。因此，考慮反應(yīng)物質(zhì)量比為3∶1時(shí)為最適宜。

圖2 反應(yīng)質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響

2.4 反應(yīng)溫度對(duì)亞鐵離子螯合率的影響 鰲合溫度及鰲合時(shí)間對(duì)鰲合效果的影響不如配位比作用明顯，大多數(shù)不同來源的植物多酚與微量元素金屬離子常溫下就能螯合成環(huán)，30 min螯合過程即可完成［6］。但是考慮實(shí)際生產(chǎn)中不同來源植物多酚種類較多，不同的植物多酚物質(zhì)再同金屬離子鰲合對(duì)反應(yīng)條件要求也略有差別，所以對(duì)不同反應(yīng)選擇最適宜鰲合溫度與時(shí)間也較為關(guān)鍵。更重要的是，螯合溫度的升高有利于植物酚類物質(zhì)的充分浸出［7］，因此要調(diào)節(jié)溫度至適于反應(yīng)的進(jìn)行。

由圖3可知，在反應(yīng)溫度為30～45℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，亞鐵離子螯合率先逐漸增大;當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí)，亞鐵離子螯合率達(dá)到最大，為(38.71±1.84)%。這是由于多酚與亞鐵離子螯合反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，因此會(huì)隨著反應(yīng)溫度的升高而鰲合反應(yīng)進(jìn)行越迅速;但是，當(dāng)反應(yīng)溫度超過45℃并且繼續(xù)增大時(shí)，多酚與亞鐵離子螯合率逐漸降低，這是因?yàn)槭聦?shí)上螯合反應(yīng)溫度過高反而會(huì)使螯合反應(yīng)進(jìn)行不完全，而且會(huì)對(duì)原料多酚結(jié)構(gòu)造成不可逆破壞，造成原料的損失;且在高溫下反應(yīng)又會(huì)對(duì)螯合物結(jié)構(gòu)造成不可逆破壞。因此，考慮螯合溫度45℃為最適宜反應(yīng)溫度。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)螯合率的影響

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化樟子松樹皮多酚與亞鐵離子螯合試驗(yàn) 根據(jù)樟子松樹皮多酚與亞鐵離子螯合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取螯合pH，螯合質(zhì)量比以及螯合溫度作為3個(gè)影響因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以螯合率為響應(yīng)值，做3因素3水平共17組響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以研究所選的3個(gè)因素對(duì)樟子松樹皮多酚亞鐵離子螯合的綜合影響，3因素3水平編碼見表1。利用Design-Expert 7.0設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，試驗(yàn)測定結(jié)果見表2。

通過Design-expert7.0軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，對(duì)所測得的結(jié)果擬合后得到的回歸方程為:R=38.52-3.27X1+0.57X2-0.69X3+0.41X1X2+0.65X1X3+0.53X2X3-6.77X12-3.12X22-1.45X32，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 5。回歸模型方差分析見如下:

表1 多酚與亞鐵離子螯合工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表2 多酚與亞鐵離子螯合工藝響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

由此看出，模型的回歸顯著性水平P＜0.000 1，小于0.05，表明亞鐵離子螯合率與各因素(螯合pH、質(zhì)量比、反應(yīng)溫度)之間有顯著關(guān)系，而誤差項(xiàng)不顯著，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，說明此模型能充分解釋響應(yīng)中的變異。從分析結(jié)果可以看出，反應(yīng)pH(X1)、質(zhì)量比(X2)以及反應(yīng)溫度(X3)(P＜0.01)均極顯著，說明3個(gè)因素對(duì)亞鐵離子螯合率的影響均極為突出;除了反應(yīng)pH(X1)與質(zhì)量比(X2)間的交互影響(P＞0.05)不顯著外，其他因素間的交互影響(P＜0.05)均顯著。為進(jìn)一步驗(yàn)證最佳點(diǎn)的數(shù)值，應(yīng)用SAS8.0響應(yīng)面分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果為:樟子松樹皮多酚與亞鐵離子螯合的最優(yōu)工藝條件的編碼值對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)值為X1=6.75，X2=3.05，X3=43.58℃，此時(shí)方程的最大預(yù)測值為39.04%。

圖4 螯合pH與反應(yīng)溫度交互作用對(duì)多酚螯合亞鐵螯合率的綜合影響

圖5 螯合質(zhì)量比與反應(yīng)溫度交互作用對(duì)多酚螯合亞鐵螯合率的綜合影響

其中螯合pH與反應(yīng)溫度、質(zhì)量比與反應(yīng)溫度間存在著交互作用，具體交互作用如圖4、5所示。在響應(yīng)面優(yōu)化的條件下進(jìn)行驗(yàn)證，獲得最大螯合率的螯合條件是螯合pH=6.8，反應(yīng)質(zhì)量比為3.1∶1，反應(yīng)溫度為43.6℃，平行試驗(yàn)測得制備出的亞鐵離子螯合物螯合率(39.16±0.89)%，回歸模型的預(yù)測值與實(shí)測值非常接近。

2.6 紫外光譜分析 從松多酚與松多酚亞鐵離子螯合物的紫外全波長掃描圖譜可以看出:當(dāng)松多酚與亞鐵離子螯合成環(huán)后，其吸收峰會(huì)產(chǎn)生一定程度的偏移，說明松多酚與亞鐵離子發(fā)生了螯合反應(yīng)而改變了松多酚原有結(jié)構(gòu)，由松多酚以及其亞鐵螯合物紫外圖譜(圖6)可知，松多酚的最大吸收峰出現(xiàn)在波長為317 nm處，且最大吸光值為2.642;而松多酚螯合亞鐵的最大吸收峰出現(xiàn)在波長為299 nm處，且最大吸收峰高度明顯下降，最大吸光值僅為1.451，說明松多酚與亞鐵離子因發(fā)生螯合反應(yīng)而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖6 樟子松樹皮多酚二級(jí)純化產(chǎn)物及其螯合亞鐵紫外圖譜

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化水體系合成法制備樟子松樹皮多酚螯合亞鐵制備工藝，得到最佳條件為螯合pH為6.8，質(zhì)量比為3.1∶1，螯合溫度為43.6℃，此工藝條件下樟子松樹皮多酚與亞鐵離子發(fā)生螯合反應(yīng)螯合率可達(dá)到(39.16±0.89)%。通過紫外光譜分析研究表明，樟子松樹皮多酚與亞鐵離子發(fā)生螯合反應(yīng)，導(dǎo)致其原有結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，反應(yīng)產(chǎn)品呈螯合物特征結(jié)構(gòu)。

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