成人隱匿性自身免疫性糖尿病早期血漿SERPING1的變化及意義*

秦 雯 張佳俐 夏 寧△

成人隱匿性自身免疫性糖尿?。╨atent autoim?mune diabetes in adult,LADA）以與糖尿病相關(guān)的自身抗體陽(yáng)性為特征[1]。LADA患者胰腺β細(xì)胞自身免疫性破壞發(fā)生的速度較慢，使其早期血糖的增高有一個(gè)潛伏期。盡管LADA在發(fā)病初期與2型糖尿?。═2DM）很相似[2-3]，但就治療方法而言兩者應(yīng)當(dāng)有所區(qū)別[4-5]。因此，早期診斷LADA有重要的臨床價(jià)值。最近，有蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)血漿C1酯酶抑制物（plasma protease C1 inhibitor,SERPING1）可能成為1型糖尿?。═1DM）的新的血漿標(biāo)志物[6]。和T1DM一樣同屬自身免疫性糖尿病的LADA，其患者血漿中SERPING1的表達(dá)是否也有同樣趨勢(shì)尚鮮見報(bào)道。本研究旨在評(píng)價(jià)SERPING1與LADA的關(guān)系，進(jìn)而探討SERPING1水平變化對(duì)LADA的早期預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011年8月—12月在我院內(nèi)分泌門診就診的LADA患者58例，T1DM患者52例，T2DM患者65例納入本研究。上述糖尿病患者均符合2003年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且均為病程在6個(gè)月之內(nèi)的早期患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）線粒體基因突變糖尿病患者。（2）青少年起病的成人型糖尿病患者。（3）其他原因所致糖尿病和妊娠期糖尿病患者。（4）其他自身免疫疾病患者。另選同期條件相匹配的健康志愿者83例為正常對(duì)照（NC）組。所有258例參與研究者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 受試者過夜禁食12 h，次日清晨空腹采肘正中靜脈血檢測(cè)空腹C肽（FCP）、空腹血糖（FPG）及糖化血紅蛋白（HbA1c）水平；繼而行饅頭餐試驗(yàn)（食用100 g標(biāo)準(zhǔn)面粉制成的饅頭），5 min內(nèi)食用完，從開始進(jìn)食第一口饅頭起算時(shí)間，于進(jìn)食饅頭餐2 h后取血檢測(cè)餐后2 h血糖（2 hPG）、餐后2 h C肽（2 hCP）水平。另留取部分空腹血標(biāo)本以4℃恒溫離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，分離血漿于-80℃冰箱保存，統(tǒng)一檢測(cè)谷氨酸脫羧酶抗體（glutamic acid decarboxylase, GADA）及SERPING1水平。

1.2.2 一般實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) HbA1c采用高效液相法，美國(guó)Bio-Rad公司D-10全自動(dòng)糖化血紅蛋白儀測(cè)定；FPG、2 hPG采用葡萄糖氧化酶法，西門子公司ADVIA2400全自動(dòng)生化儀測(cè)定；FCP、2 hCP采用化學(xué)發(fā)光法，美國(guó)DPC公司全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（IMMULATE-1000）測(cè)定；GADA使用北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）診斷試劑盒自行集中測(cè)定（該試劑盒的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：Cutoff值=陰性對(duì)照平均光密度（OD）值×2.1；樣本OD值≥Cutoff值為陽(yáng)性，＜Cutoff值為陰性）。

1.2.3 SERPING1檢測(cè) 使用武漢華美生物工程公司生產(chǎn)的人類SERPING1蛋白競(jìng)爭(zhēng)法ELISA測(cè)量試劑盒，并在終止反應(yīng)后15 min內(nèi)、在450 nm波長(zhǎng)下讀取OD值，各個(gè)復(fù)孔取平均值。運(yùn)用回歸分析做擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出各樣品的實(shí)際濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布者采用（±s）表示，多組間樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。偏態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)（M）表示，采用多個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal-wal?lis秩和檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量為χ2，組間多重比較采用數(shù)據(jù)編秩轉(zhuǎn)換后SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。血漿SERPING1與其他指標(biāo)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析?；貧w分析采用多元逐步線性回歸分析法。采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析SERPING1早期預(yù)測(cè)LADA的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較 各組性別構(gòu)成、病程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LADA組年齡高于T1DM組（P＜0.05），而與其他各組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LADA組與T1DM組、T2DM組、NC組的HbA1c、FPG、2 hPG、FCP、2 hCP指標(biāo)間差異部分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。GADA作為糖尿病分型指標(biāo)納入檢測(cè)，但組間比較因?yàn)長(zhǎng)ADA組、T1DM組GA?DA陰性為0，而T2MD組、正常組陽(yáng)性為0，不宜行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，待以后數(shù)據(jù)資料增加后再行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

Table 1 Baseline characteristics in four groups表1 各組一般資料的基線水平 （±s）

Table 1 Baseline characteristics in four groups表1 各組一般資料的基線水平 （±s）

表中數(shù)據(jù)描述方式為例或±s或M；＊＊P＜0.01；a與LADA組比較，P＜0.05

組別LADA組T1DM組T2DM組NC組F或χ2 n 58 52 65 83性別（男/女）32/26 28/24 37/28 48/35 0.245年齡（歲）37.2±5.1 12.2±3.8a 38.2±4.7 36.8±4.7 413.435＊＊病程（月）4.8±1.1 4.5±1.2 4.7±1.2 -0.819 HbA1c（%）8.2±0.8 8.6±0.8a 7.8±0.7a 5.1±0.4a 416.729＊＊組別LADA組T1DM組T2DM組NC組F或χ2 n 58 52 65 83 FPG（mmol/L）9.2±1.7 10.0±1.6a 9.0±1.2 5.1±0.7a 210.807＊＊2 hPG（mmol/L）15.8±1.5 17.0±1.9a 13.8±0.8a 6.1±1.1a 985.843＊＊FCP（μg/L）0.705 0.530a 1.87a 1.48a 204.547＊＊2 hCP（μg/L）1.3±0.2 1.0±0.2a 6.0±1.5a 5.6±1.9a 262.050＊＊GADA（+/-）58/0 52/0 0/65 0/83 -

2.2 各組SERPING1水平比較 LADA組、T1DM組、T2DM組、NC組血漿SERPING1（mg/L）分別為325.00±72.70、337.26±86.70、296.45±71.20、292.04± 58.46，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.991，P＜0.01），LADA組高于T2DM組、NC組（P＜0.05），而與T1DM組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 LADA組SERPING1與其他指標(biāo)的關(guān)系 在LADA組SERPING1水平與FCP呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.680），與HbA1c、FPG、2 hPG呈正相關(guān)（rs分別為0.550、0.547和0.476，均P＜0.05）。以血漿SERPING1為因變量，年齡、病程、FPG、2 hPG、HbA1c、FCP、2 hCP為自變量，行多元逐步線性回歸分析，因?yàn)長(zhǎng)ADA組樣本量較小，根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)將年齡、病程、FPG、2 hPG、HbA1c、FCP、2 hCP作為自變量，逐個(gè)納入行多元逐步回歸分析，納入檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.1，排除標(biāo)準(zhǔn)P＞0.1所得結(jié)果，初步排除年齡和2 hCP。最終將其余5個(gè)指標(biāo)作為自變量，行多元線性回歸分析，結(jié)果FCP進(jìn)入回歸方程（P＜0.001）,見表2。

Table 2 The multiple regression analysis of SERPING1 and related factors in patients with LADA表2影響LADA患者SERPING1相關(guān)因素的多元回歸分析

2.4 血漿SERPING1對(duì)LADA的早期預(yù)測(cè) 采用ROC曲線分析SERPING1早期鑒別LADA和T2DM患者的效能，見圖1。ROC曲線下面積（AUC）為0.613，與完全隨機(jī)獲得的面積0.50間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），95%CI為0.514～0.712。SERPING1早期預(yù)測(cè)LADA的最佳臨界值為289.71 mg/L，靈敏度69%，特異度48%。

Figure 1 ROC curves of SERPING1圖1SERPING1的ROC曲線

3 討論

LADA的早期診斷一直是臨床上比較困難的問題，目前自身抗體檢測(cè)陽(yáng)性是其最直接的依據(jù)。但是自身抗體的種類很多，若一一進(jìn)行篩查成本太高；此外，自身抗體的產(chǎn)生需要一定的時(shí)間（特別是IgG抗體）；而且隨著病程的延長(zhǎng)，有的抗體會(huì)逐漸減弱[7]；再加上許多尚未被醫(yī)學(xué)界發(fā)現(xiàn)和識(shí)別的自身抗體，可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陰性；這些都不利于LADA的早期診斷。

SERPING1本質(zhì)上是一種105 ku的分泌蛋白。它既是絲氨酸蛋白酶抑制劑，能高效地抑制糜蛋白酶和激肽釋放酶，也是體內(nèi)主要的抗炎蛋白[8]。它能通過和C1r或者C1s蛋白酶結(jié)合形成低活性的化合物而控制C1復(fù)合體的激活[9]，可能在調(diào)節(jié)一些重要的生理學(xué)路徑方面扮演重要的角色。這些路徑包括補(bǔ)體激活、血液凝固、纖維蛋白溶解和產(chǎn)生激肽等。SERPING1主要參與如下的生理功能：血液循環(huán)、血液凝固的內(nèi)源性途徑、補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑、纖維蛋白溶解、先天免疫應(yīng)答[10]、補(bǔ)體激活和外源性凝集素的負(fù)調(diào)控、血小板的激活和脫顆粒。有研究顯示某些與炎癥和微血管相關(guān)的基因在糖尿病幼鼠模型中是上調(diào)的，其中就包括SERPING1[11]。Zhang等[6]運(yùn)用LC-MS蛋白組學(xué)策略對(duì)經(jīng)典T1DM、T2DM和正常人進(jìn)行對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典T1DM中血清蛋白組學(xué)表現(xiàn)出系統(tǒng)性的先天免疫調(diào)節(jié)異常，并發(fā)現(xiàn)SERP?ING1是區(qū)分經(jīng)典T1DM和T2DM的指標(biāo)，它在經(jīng)典T1DM中是上調(diào)的。

本研究顯示，LADA組血漿SERPING1高于T2DM組和正常對(duì)照組。由于LADA與T1DM有著相似的發(fā)病機(jī)制，所以可以認(rèn)為本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果有一致性。進(jìn)一步通過相關(guān)分析及多元逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，SERPING1與FCP呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)CP是血漿SERPING1的主要影響因素。而FCP又是體現(xiàn)胰島功能是否損害的指標(biāo)，這就表明SERPING1對(duì)早期預(yù)測(cè)LADA有提示作用，故可采用ROC曲線評(píng)價(jià)SERPING1值對(duì)早期LADA患者的檢出效能。ROC曲線是國(guó)際公認(rèn)的評(píng)價(jià)診斷效能的客觀指標(biāo)，而0.5＜AUC≤0.7表示診斷價(jià)值一般。本研究通過ROC曲線分析證明，SERPING1預(yù)測(cè)LADA的曲線下面積恰在此范圍內(nèi)，所以單獨(dú)依靠SERPING1早期預(yù)測(cè)LADA的精準(zhǔn)性存在一定缺陷，而SERPING1聯(lián)合其他指標(biāo)檢測(cè)將大大提高其診斷效能。雖然ROC曲線表明SERPING1對(duì)LADA的早期預(yù)測(cè)價(jià)值一般，但是通過各組間SERPING1的比較、SERPING1與LADA組中其他資料及指標(biāo)的相關(guān)分析，均提示其與LADA關(guān)系密切，SERPING1可能參與到LADA的早期發(fā)病過程。目前有研究證實(shí)[8,11]，由于SERP?ING1是連接及補(bǔ)體系統(tǒng)中主要的蛋白酶抑制劑，因此它也是一種有效的抗炎蛋白，并可能成為一種針對(duì)多種炎癥性疾?。òㄗ陨硌装Y性疾?。┑闹委煹鞍祝欢@些炎癥性疾病中已被研究證實(shí)的有敗血癥、心肌梗死、遺傳性血管性水腫等[12-13]。LADA也是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的一種自身免疫性疾病，能否以SERPING1參與LADA的發(fā)病機(jī)制為切入點(diǎn)，探索治療LADA的新途徑是今后研究的一個(gè)思路。

本研究存在一定的局限性：首先，本研究的樣本量稍小，缺乏多中心研究。其次，由于在已知的LA?DA自身免疫性抗體中，GADA在患者中的陽(yáng)性率較高，所以本研究只收集了GADA陽(yáng)性的LADA患者的血漿標(biāo)本，今后將加入其他自身免疫性抗體陽(yáng)性的LADA標(biāo)本、進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心的深入研究?？傊谝陨系难芯勘尘芭c臨床研究結(jié)果，可以初步認(rèn)為雖然SERPING1可在一定程度上預(yù)測(cè)LADA的發(fā)生，但仍需綜合臨床和其他實(shí)驗(yàn)室檢查才能作出準(zhǔn)確判斷；SERPING1對(duì)LADA的發(fā)病機(jī)制和治療有一定的提示作用，不過還有待更深入的研究確認(rèn)。

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