microRNA-21通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化調(diào)節(jié)心肌梗死后的心臟重塑

郭 東 張閩紅 肖清萍 劉建文

心肌梗死（心梗）是心臟衰竭最常見(jiàn)的病因之一，發(fā)病兇險(xiǎn)，致殘率和致死率均高，因此研究如何改善心梗后心臟的修復(fù)能力具有重要的臨床價(jià)值。miRNA（miR）是一類非編碼的小分子RNA，通過(guò)抑制靶基因的翻譯過(guò)程，參與許多重要的生物學(xué)過(guò)程[1]。研究表明miR-21在急性心肌缺血的早期病理過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。過(guò)表達(dá)miR-21可以減少腫瘤壞死因子（TNF）-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[3]。本研究采用小鼠心肌梗死模型，檢測(cè)心梗交界區(qū)心臟組織miR-21的表達(dá)情況，同時(shí)利用miR-21的模擬物（miR-21 mimic）轉(zhuǎn)染小鼠原代心臟成纖維細(xì)胞，觀察過(guò)表達(dá)miR-21對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖與分化的影響，為促進(jìn)心梗后心臟的修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量相近的C57/BL6小鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量（23±3）g，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。

1.2 試劑和儀器 RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR試劑（日本TAKARA公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；脂質(zhì)體Lipfectamine 2000（美國(guó)in?vitrogen公司）；化學(xué)修飾的miR-21 mimic（上海吉瑪生物科技有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（美國(guó)ABI公司）；蛋白提取試劑盒（碧云天）；α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、小鼠Smad同源物7（Smad7）以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（Santa Cruz,USA）；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（廣州市瑞博生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組和心肌梗死組，每組20只。假手術(shù)組開胸但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈；心肌梗死組阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支7 d。2組均為普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

1.3.2 小鼠心梗模型的建立 心梗模型制作參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。胸骨左緣第2～4肋開胸，以左冠脈主干為標(biāo)志，在左心耳下方2 mm處進(jìn)針，6-0號(hào)絲線結(jié)扎左前降支，當(dāng)結(jié)扎區(qū)域變白，心電圖2個(gè)以上的肢導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段上抬0.2 mV則判斷為造模成功。

1.3.3 HE染色 處死小鼠，用含有肝素的生理鹽水灌洗以去除心臟組織的血液。取心臟，用10%福爾馬林固定組織，脫水，石蠟包埋，切成4 μm厚切片，進(jìn)行HE染色，觀察心肌梗死后心肌細(xì)胞存活及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-21的含量 應(yīng)用Trizol法提取各組小鼠心臟組織的RNA，用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物特異性反轉(zhuǎn)miR-21和U6。第一步引物退火，取2 μg RNA與1 μL miR-21（100 mg/L）和1 μL U6（100 mg/L）特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物混合，反應(yīng)條件為70℃10 min，4℃10 min。第二步合成cDNA第一鏈，在混合物中分別加入10× buffer、2 μL MgCl2（20.8 mol/L）、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，補(bǔ)水至20 μL，充分混勻，反應(yīng)條件為37℃1 h，4℃10 min。生成的cD? NA取1μL，與10 μL 2×SYBR混合，再加入7 μL水和1 μL上、下游引物，混勻?yàn)?0 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95℃5 min，95℃15 s，60℃60 s，40個(gè)循環(huán)。miR-21的表達(dá)水平用Cq值（熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)的循環(huán)數(shù)）表示，內(nèi)參為U6。引物序列見(jiàn)表1。

Table 1 The stem-loop and PCR primers of different genes表1 目的基因莖環(huán)引物及PCR引物序列

1.3.5 小鼠成纖維細(xì)胞的提取 無(wú)菌條件下取出心臟于6 cm培養(yǎng)皿中，D-hank’s液漂洗，剪碎心臟放入15 mL離心管中，加入5倍體積0.05%胰酶，37℃水浴5 min，反復(fù)吹打、靜置，待自然沉降后棄去上清液。沉淀加入約5倍體積0.08%胰蛋白酶及0.1%膠原酶Ⅱ混合液，反復(fù)吹打約10 min，離心取沉淀后以10 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于6 cm培養(yǎng)皿中。60～90 min后更換新鮮20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.3.6 miR-21 mimic的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化成纖維細(xì)胞，接種至6孔板中，使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞濃度能夠達(dá)到30%～50%。實(shí)驗(yàn)分3組：隨機(jī)對(duì)照組、空白對(duì)照組和miR-21 mimic組。各組分別在50 μL Opti-MEM加入1.25 μL PBS、陰性對(duì)照儲(chǔ)存液和miR-21 mimic儲(chǔ)存液（20 μmol/L），室溫孵育5 min。用50 μL Opti-MEM稀釋1 μL lipo2000，溫和混勻并室溫孵育5 min。將以上兩液體溫和混勻，室溫孵育20 min。將混合液加入含有細(xì)胞的1 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，溫和混勻，培養(yǎng)4～6 h后，將孔中含mimic-lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-21的含量。

1.3.7 Western blot法測(cè)定成纖維細(xì)胞α-SMA及Smad7蛋白的表達(dá) 心臟原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)1周后，按照試劑盒說(shuō)明提取蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。在10%聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)膜后將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，然后分別加入相對(duì)應(yīng)的一抗（1∶500稀釋），4℃孵育過(guò)夜。第2天膜浸于一抗溶液中，室溫平衡1 h后，洗膜3次，每次10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。TBST溶液洗膜3次，每次10 min。利用辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶，不做放射自顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3.8 EdU檢測(cè)成纖維細(xì)胞的增殖 成纖維細(xì)胞以（4×103～1×104）/孔接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)分組同1.3.6，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后2 d每孔加入50 μmol/L EdU試劑100 μL，于37℃5%CO2條件下孵育2 h；棄培養(yǎng)液，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛，室溫孵育30 min；棄固定液，每孔加入50 μL 2 g/L甘氨酸，孵育10 min；棄甘氨酸溶液，每孔加入100 μL PBS，孵育5 min；棄PBS，每孔加入100 μL 0.5%Triton，孵育10 min，PBS沖洗1次；每孔加入100 μL 1×Apollo?染色反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后，棄染色反應(yīng)液；PBS沖洗1次；每孔加入10 μL 1×DAPI反應(yīng)液，避光、室溫孵育10 min；在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察及圖片采集。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖率(%)=EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)× 100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 常規(guī)光鏡下可見(jiàn)心肌梗死組梗死區(qū)主要是膠原纖維和成纖維細(xì)胞，幾乎無(wú)存活心肌細(xì)胞；梗死交界區(qū)由心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞組成，且梗死區(qū)和交界區(qū)均有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而遠(yuǎn)端區(qū)主要是存活的心肌細(xì)胞，表明小鼠心肌梗死造模成功，見(jiàn)圖1。

Figure1 The myocardial tissue sections of HE staining（HE,×400）圖1 HE染色光鏡下心肌組織切片（HE,×400）

2.2 2組心臟梗死交界區(qū)miR-21的基因表達(dá)比較 與無(wú)梗死的假手術(shù)組（1.620±0.451）×10-4相比，心肌梗死組梗死交界區(qū)的miR-21的表達(dá)量（6.043± 0.231）×10-4明顯增加（t=12.102，P＜0.01）。

2.3 3組成纖維細(xì)胞中miR-21的基因表達(dá)及EdU陽(yáng)性率比較 miR-21 mimic組成纖維細(xì)胞中的miR-21基因表達(dá)及EdU陽(yáng)性率明顯高于隨機(jī)對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.01），而后2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

Table 2 Comparison of gene expression and EdU positive percentage of miR-21 in fibroblast treated with different conditions表2 不同因素處理成纖維細(xì)胞后miR-21基因表達(dá)及EdU陽(yáng)性率比較 （±s）

Table 2 Comparison of gene expression and EdU positive percentage of miR-21 in fibroblast treated with different conditions表2 不同因素處理成纖維細(xì)胞后miR-21基因表達(dá)及EdU陽(yáng)性率比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，b與（2）比較，P＜0.01

組別隨機(jī)對(duì)照組（1）空白對(duì)照組（2）miR-21 mimic組（3）F n333 miR-21/U6（×10-4）1.143±0.064 1.017±0.201 4.839±0.705ab 15.418＊＊EdU陽(yáng)性率（%）12.553±1.227 13.946±1.550 27.892±1.645ab 32.632＊＊

2.4 Smad7和α-SMA蛋白表達(dá)水平的變化 隨機(jī)對(duì)照組和空白對(duì)照組的成纖維細(xì)胞Smad7表達(dá)較強(qiáng)，miR-21 mimic組轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后Smad7的表達(dá)明顯下調(diào)，條帶灰度減弱。同時(shí)miR-21 mimic組α-SMA的表達(dá)顯著上調(diào)，條帶灰度增強(qiáng)。空白對(duì)照組與隨機(jī)對(duì)照組Smad7及α-SMA蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。

Figure 2 The expression of Smad7 and α-SMA in fibroblast after overexpression of miR-21 detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-21后成纖維細(xì)胞Smad7和α-SMA蛋白的表達(dá)情況

3 討論

3.1 miR-21參與心梗后心臟的損傷和修復(fù) 目前由于臨床溶栓及急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)的廣泛應(yīng)用，已明顯減低了急性心肌梗死的死亡率。但心臟破裂作為急性心肌梗死的常見(jiàn)并發(fā)癥之一幾乎是致命性的，且其發(fā)生尚不可預(yù)測(cè)，嚴(yán)重威脅患者生命。心梗后心臟破裂的發(fā)生機(jī)制主要與心臟的重塑有關(guān)。已有文獻(xiàn)報(bào)道多種microRNA參與心臟重塑的病理過(guò)程[4]。miR-21是由單個(gè)基因編碼，在進(jìn)化上高度保守的microRNA。Lagos-Quintana等[5]報(bào)道m(xù)iR-21可以在心臟、小腸、脾臟等多種器官中表達(dá)。有研究證實(shí)，miR-21參與多種心血管疾病[6]。最新研究表明miR-21可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β受體Ⅲ（TGFβRⅢ）的表達(dá)調(diào)控心臟纖維化[7]。Yin等[8]發(fā)現(xiàn)小鼠心肌梗死24 h后，心肌梗死區(qū)miR-21表達(dá)顯著上調(diào)。Cheng等[9]在小鼠的心梗模型中證實(shí)上調(diào)的miR-21可明顯減少心肌梗死面積。本研究中，筆者成功構(gòu)建小鼠心肌梗死模型，HE染色顯示梗死區(qū)心肌細(xì)胞基本消失，并且有大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21在心肌梗死組梗死交界區(qū)表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)，表明miR-21參與心梗后心臟損傷和修復(fù)過(guò)程。

3.2 miR-21通過(guò)抑制Smad7基因激活成纖維細(xì)胞的增殖與分化 成纖維細(xì)胞的增殖與分化在心肌梗死后的心臟重塑過(guò)程中扮演重要角色。研究表明TGF-β信號(hào)通路是調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖與分化的主要信號(hào)通路[10]。本研究證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-21可以明顯激活成纖維細(xì)胞的增殖和分化。Smad7基因是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制蛋白，它與細(xì)胞膜上TGF-β受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻斷TGF-β信號(hào)在胞漿內(nèi)的傳導(dǎo)，下游信號(hào)紊亂是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失活的機(jī)制之一[11]。而抑制TGF-β/Smads信號(hào)通路可以減輕糖尿病導(dǎo)致的腎臟纖維化[12]。在本研究中，筆者利用TargetScan 4.0預(yù)測(cè)到Smad7為miR-21的下游靶基因，結(jié)果表明在成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-21可以明顯抑制Smad7的表達(dá)。因此推測(cè)在心梗模型下，miR-21通過(guò)抑制Smad7的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)TGF-β對(duì)成纖維細(xì)胞的分化，最終改善了心臟的重塑。

綜上所述，在小鼠心肌梗死模型中，miR-21在梗死交界區(qū)表達(dá)明顯上調(diào)，通過(guò)抑制靶基因Smad7的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)心梗后心臟組織的修復(fù)，此結(jié)果為有效預(yù)防心梗后心臟破裂提供了新的線索和治療靶點(diǎn)。

[1]Vogel B,Keller A,Frese KS,et al.Refining diagnostic microRNA signatures by whole-miRNome kinetic analysis in acute myocardial infarction[J].Clin Chem,2013,59(2):410-418.doi:10.1373/ clinchem.2011.181370.

[2]楊瓊,楊侃,李安瑩,等.MicroRNA-21在缺血再灌注損傷早期大鼠心肌的表達(dá)及抗細(xì)胞凋亡作用[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）, 2013,38(5):483-489.

[3]唐艷,王夢(mèng)洪.微小RNA-21對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡及磷酸脂酶-張力蛋白同源物/絲氨酸/蘇氨酸激酶/叉頭蛋白3a信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響[J].中華心血管病雜志,2013,41(2):135-142.

[4]Small EM,Frost RJ,Olson EN.MicroRNAs add a new dimension to cardiovascular disease[J].Circulation,2010,121（8）:1022-1032. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.109.889048.

[5] Lagos-Quintana M,Rauhut R,Yalcin A,et al.Identification of tis?sue-specific microRNAs from mouse[J].Current Biology,2002,12 (9):735-739.

[6]Wei Y,Schober A,Weber C.Pathogenic arterial remodeling:the good and bad of microRNAs[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2013,304(8):1050-1059.doi:10.1152/ajpheart.00267.2012.

[7] Liang H,Zhang C,Ban T,et al.A novel reciprocal loop between mi?croRNA-21 and TGFβRIII is involved in cardiac fibrosis[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(12):2152-2160.doi:10.1016/j.bio?cel.2012.08.019.

[8]Yin C,Salloum FN,Kukreja RC.A novel of microRNA in late pre?conditioning:upregulation of endothelial nitric oxide synthase and heart shock protein 70[J].Circ Res,2009,104(5):572-575.doi: 10.1161/CIRCRESAHA.108.193250.

[9]Cheng Y,Zhu P,Yang J,et al.Ischaemic preconditioning regulat?ed miR-21 protects heart against ischaemia/reperfusion injury via anti-apoptosis through its target PDCD4[J].Cardiovasc Res,2010，87(3):431-439.doi:10.1093/cvr/cvq082.

[10]Dobaczewski M,Chen W,Frangogiannis NG.Transforming growth factor(TGF)-β signaling in cardiac remodeling[J].J Mol Cell Cardi?ol,2011,51(4):600-606.doi:10.1074/jbc.M111.288944.

[11]Wang T,Zhou XT,Yu Y,et al.Inhibition of corneal fibrosis by Smad7 in rats after photorefractive keratectomy[J].Chin Med J (Engl),2013,126(8):1445-1450.

[12]Xin X,Li XH,Wu JZ,et al.Pentamethylquercetin ameliorates fibro?sis in diabetic Goto-Kakizaki rat kidneys and mesangial cells with suppression of TGF-β/Smads signaling[J].Eur J Pharmacol,2013, 713(1-3):6-15.doi:10.1016/j.ejphar.2013.04.045.