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    利莫那班對(duì)肝纖維化C57小鼠肝組織大麻素受體1及α-SMA表達(dá)的影響*

    2014-02-28 08:54:14葉立紅王翀奎陳秀麗戴二黑
    天津醫(yī)藥 2014年5期
    關(guān)鍵詞:管區(qū)大麻班組

    葉立紅 王翀奎 陳秀麗 楊 莉 戴二黑△

    近年來(lái),Hezode等[1]和Teixeira-Clerc等[2]先后發(fā)現(xiàn)大麻素及其受體在慢性肝病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著非常獨(dú)特的作用,尤其大麻素受體(cannabinoid re?ceptor,CB)1在肝纖維化方面的研究逐漸受到重視。為了更深入研究CB1在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制,本研究通過(guò)建立四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的C57小鼠肝纖維化模型,觀察肝組織中CB1和肝纖維化特異性標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)變化,以及CB1拮抗劑利莫那班對(duì)CB1及α-SMA表達(dá)的影響,為今后以CB1為靶點(diǎn)進(jìn)行抗肝纖維化治療提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。C57小黑鼠,雄性,無(wú)特定病原體(SPF)級(jí),33只,體質(zhì)量(20±3)g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,合格證號(hào):0029674。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水和進(jìn)食。(2)主要試劑及儀器。日本OLYMPUS雙目顯微鏡,法國(guó)JOUAN MR型超低溫冰箱,北京中科恒信彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)。CB1單克隆抗體、利莫那班購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司,α-SMA單克隆抗體購(gòu)自香港abcam公司,PV-6000免疫組化試劑盒及DAB顯色液均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。CCl4購(gòu)自天津市標(biāo)準(zhǔn)件科技有限公司,橄欖油購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰尽?/p>

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物分組及造模 正式實(shí)驗(yàn)前選取3只小鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)造模2周,2周后處死經(jīng)病理證實(shí)纖維化模型成功。其余30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及利莫那班組,每組10只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每周一、四給予正常對(duì)照組腹腔注射橄欖油,橄欖油用量按0.01 mL/g體質(zhì)量,模型對(duì)照組、利莫那班組腹腔注射10% CCl4造模,10%CCl4用量按0.01 mL/g體質(zhì)量。每次腹腔注射前均檢測(cè)體質(zhì)量,調(diào)整注射劑量。造模2周后,于繼續(xù)造模的同時(shí),正常對(duì)照組和模型對(duì)照組生理鹽水灌胃0.2 mL/次,1次/d,利莫那班組利莫那班灌胃10 mg/kg,1次/d[3],再連續(xù)實(shí)驗(yàn)6周,其中模型對(duì)照組和利莫那班組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各死亡1只。

    1.2.2 肝組織標(biāo)本的收集與處理 各組小鼠分別在造模的第8周最后一次腹腔注射用藥后4 h,稱質(zhì)量后4%水合氯醛腹腔注射麻醉處死,經(jīng)下腔靜脈無(wú)菌采血,并取出肝臟經(jīng)冷生理鹽水灌注沖洗殘血后,切取部分肝組織放入10%福爾馬林固定液中保存,用于病理診斷及免疫組化檢測(cè),其余肝臟組織放入EP管中迅速置液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 病理學(xué)檢測(cè) 所有肝臟標(biāo)本均在10%福爾馬林中固定96 h,依次用75%、80%、95%、100%乙醇進(jìn)行梯度脫水,二甲苯透明,組織浸蠟,石蠟包埋。常規(guī)病理切片,切片厚度為4 μm,分別進(jìn)行HE和Masson三色染色,中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變,并進(jìn)行小鼠肝組織纖維化評(píng)分[4]。

    1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用SP法檢測(cè)肝組織中CB1和 α-SMA表達(dá),已知陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照,PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照,并進(jìn)行半定量評(píng)分[5]。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,同一指標(biāo)的組間比較采用單因素方差分析,分析前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊時(shí)用LSD法,若方差不齊則用Tamhane’s T2法,兩指標(biāo)間的相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 造模6周時(shí)各組肝組織形態(tài)學(xué)改變 正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝板以小葉中央靜脈(CLV)為中心呈放射狀排列,匯管區(qū)(P)僅見(jiàn)極少量膠原纖維,CLV周圍未見(jiàn)膠原纖維。模型對(duì)照組CLV之間、CLV和P之間纖維間隔形成,部分區(qū)域纖維間隔較寬伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂,但未形成典型假小葉。利莫那班組肝臟CLV周圍可見(jiàn)少量膠原纖維沉積,匯管區(qū)纖維組織呈星芒狀增生。

    2.2 CB1和α-SMA在肝組織中的表達(dá)及定位情況 CB1主要表達(dá)于肝細(xì)胞漿和肝竇內(nèi)肝星狀細(xì)胞(HSC)中,另外在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和匯管區(qū)及纖維間隔的肌成纖維母細(xì)胞也有陽(yáng)性表達(dá)。正常對(duì)照組CB1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較少,僅3例在肝細(xì)胞及HSC少量表達(dá);模型對(duì)照組可見(jiàn)大量陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,且隨著壞死及纖維組織增生程度的加重,CB1陽(yáng)性表達(dá)量也逐漸增加;利莫那班組也可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá),但陽(yáng)性細(xì)胞較模型對(duì)照組明顯減少,見(jiàn)圖1~4。α-SMA在正常對(duì)照組僅少量表達(dá)于血管壁平滑肌細(xì)胞(中央靜脈及匯管區(qū)的小葉間動(dòng)脈、小葉間靜脈的血管壁);模型對(duì)照組α-SMA表達(dá)除分布于血管壁外,主要表達(dá)于肝竇內(nèi)活化的HSC、匯管區(qū)和纖維間隔內(nèi),且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多;利莫那班組α-SMA也主要表達(dá)肝竇內(nèi)活化的肝星狀細(xì)胞、匯管區(qū)和纖維間隔內(nèi),但陽(yáng)性細(xì)胞較模型對(duì)照組明顯減少,見(jiàn)圖5、6。

    Figure 1 The positive expression of CB1 in normal control group(SP,×100)圖1 正常對(duì)照組肝細(xì)胞CB1陽(yáng)性表達(dá)(SP,×100)

    Figure 2 The positive expression of CB1 in portal area of model control group(SP,×100)圖2 模型對(duì)照組匯管區(qū)內(nèi)外CB1陽(yáng)性表達(dá)(SP,×100)

    Figure 3 The positive expression of CB1 in model rimonabant group(SP,×100)圖3 利莫那班組CB1陽(yáng)性表達(dá)(SP,×100)

    Figure 4 The positive expression of CB1 in endothelial cells of model control group(SP,×400)圖4 模型對(duì)照組肝竇及內(nèi)皮細(xì)胞CB1陽(yáng)性表達(dá)(SP,×400)

    Figure 5 The positive expression of α-SMA in portal area of、model control group(SP,×100)圖5 模型對(duì)照組匯管區(qū)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)(SP,×100)

    Figure 6 The positive expression of α-SMA in portal area of model rimonabant group(SP,×100)圖6 利莫那班組匯管區(qū)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)(SP,×100)

    2.3 各組肝組織CB1、α-SMA和纖維化評(píng)分(S評(píng)分)比較 見(jiàn)表1。模型對(duì)照組、利莫那班組肝組織CB1評(píng)分、α-SMA評(píng)分及S評(píng)分均高于正常對(duì)照組(均P<0.05),利莫那班組肝組織CB1評(píng)分、α-SMA評(píng)分及S評(píng)分均低于模型對(duì)照組(均P<0.05)。

    Table 1 Comparison of CB1,α-SMA and S scores between three groups表1 各組肝組織CB1、α-SMA和S評(píng)分結(jié)果比較(±s)

    Table 1 Comparison of CB1,α-SMA and S scores between three groups表1 各組肝組織CB1、α-SMA和S評(píng)分結(jié)果比較(±s)

    *P<0.05,**P<0.01,表2同;a與正常對(duì)照組比較,b與模型對(duì)照組比較,P<0.05

    正常對(duì)照組模型對(duì)照組利莫那班組F 0.60±0.36 3.57±0.68a 1.49±0.54ab 97.267**10 99 0.89±0.50 5.18±1.29a 3.74±1.51ab 26.314**0.92±0.47 5.32±1.31a 3.60±1.53ab 31.821**

    2.4 各組肝組織CB1、α-SMA及S評(píng)分之間的相關(guān)性 各組小鼠肝組織CB1評(píng)分、α-SMA評(píng)分及S評(píng)分之間均呈正相關(guān)(均P<0.05),見(jiàn)表2。

    Table 2 The correlation of CB1,α-SMA and S scores between three groups表2 各組肝組織CB1、α-SMA和S評(píng)分之間的相關(guān)性(r)

    3 討論

    內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是由大麻素及其相應(yīng)受體構(gòu)成的一個(gè)生理系統(tǒng),目前認(rèn)為內(nèi)源性大麻素具有廣泛的生物學(xué)作用,其作用發(fā)揮主要通過(guò)兩種受體即CB1和CB2而實(shí)現(xiàn)[6]。研究表明,CB1的激活可促進(jìn)肝纖維化的形成,利莫那班是第一個(gè)CB1特異性阻斷劑,可有效減輕肝纖維化的發(fā)生[7]。本研究顯示,正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及利莫那班組CB1表達(dá)水平變化與S評(píng)分均呈正相關(guān),證明肝組織CB1表達(dá)水平變化與肝纖維化進(jìn)展程度相一致,因此CB1有促進(jìn)肝臟纖維化產(chǎn)生的作用;同時(shí),與模型對(duì)照組相比,利莫那班組肝組織CB1表達(dá)量明顯降低,提示利莫那班可抑制纖維組織增生,從而起到抗肝纖維化的作用。研究認(rèn)為內(nèi)源性大麻素產(chǎn)生導(dǎo)致靶向性HSC的活化增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[7],活化的HSC是肝纖維化發(fā)生過(guò)程中產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展的主要細(xì)胞,而α-SMA是HSC活化的特異性標(biāo)志物,其表達(dá)水平的強(qiáng)弱程度與肝纖維化密切相關(guān),已得到公認(rèn)[8]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),正常對(duì)照組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞輕微,而模型對(duì)照組及利莫那班組α-SMA主要表達(dá)于HSC、匯管區(qū)和纖維間隔等纖維化發(fā)生的前沿部位,但利莫那班組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)量較模型對(duì)照組顯著減少,進(jìn)一步證實(shí)α-SMA表達(dá)與肝纖維化發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系,而經(jīng)利莫那班干預(yù)后的小鼠肝組織α-SMA則表達(dá)均明顯減弱。Julien等[9]研究證明,利莫那班導(dǎo)致的肝纖維化程度減輕與肌成纖維母細(xì)胞(即活化的HSC)凋亡增加和增殖的降低有關(guān),對(duì)于CB1基因敲除的小鼠,利莫那班可以抑制肌成纖維樣母細(xì)胞的增殖。筆者前期通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)方法研究利莫那班對(duì)HSC-T6細(xì)胞和原代HSC增殖的影響,發(fā)現(xiàn)利莫那班可通過(guò)抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和局部黏著斑激酶(FAK)蛋白磷酸化以及下調(diào)CB1 mRNA水平,抑制HSC的增殖和ECM的表達(dá),并且可以促進(jìn)HSC的凋亡[10]。

    總之,大麻素受體系統(tǒng)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用,CB1的激活可促進(jìn)肝纖維化的形成。利莫那班作為CB1的阻斷劑,通過(guò)抑制CB1表達(dá),進(jìn)而抑制HSC的增殖和激活,并可促進(jìn)HSC凋亡,最終抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)對(duì)大麻素受體及其拮抗劑的深入研究,將有助于開(kāi)發(fā)以此為靶點(diǎn)的新型抗肝纖維化藥物。

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