康腦液對局灶性腦缺血再灌注大鼠Pi3k mRNA與Akt mRNA的影響*

肖志娟 趙志敏 鄒玉安 薛 茜 邢立強(qiáng)

缺血性腦血管病（ICVD）是中老年人的常見病， 約占全部腦血管病(VCD)的80%，是人類的第三大致死病因。因此，ICVD的防治非常重要。Pi3k/akt通路是體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。1999年Kitagawa等[1]首次報(bào)道腦缺血可激活Pi3K/akt信號通路，近年來，不少研究證實(shí)Pi3k/akt通路可對腦缺血產(chǎn)生的保護(hù)作用[2-3]。本研究制作大鼠腦缺血再灌注模型，觀察康腦液對模型大鼠神經(jīng)功能的影響，探討其可能作用機(jī)制，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SPF級雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量（270±20）g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心，許可證號：SCXK(京)2011-0012。（2）藥品與試劑。尼莫地平：河北永豐藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字H13021882,規(guī)格20 mg)；康腦液：黃芪、丹參、川芎、葛根、鉤藤(后下)、三七粉等組成(購于河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院)。三七粉除外，所有藥材用冷水浸泡30 min，水位超過藥約5 cm為宜。先用武火煮沸，再改用文火慢煎10～20 min，每劑中藥共煎煮3次，過濾出藥渣，將3次煎煮的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%的康腦液(每mL含生藥量4 g、2 g、1 g)，存放于4℃冰箱備用。栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品編號2432-A4)，Pi3k、Akt原位雜交試劑盒購買于武漢博士德公司。（3）主要實(shí)驗(yàn)儀器。電腦生物組織包埋機(jī)、電腦生物組織攤烤片機(jī)(浙江金華科迪)，石蠟切片機(jī)、自動(dòng)脫水機(jī)(美國Thermo)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS CX21型)，顯微攝影裝置(日本NIKON)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，康腦液高、中、低劑量組和尼莫地平組。各組大鼠實(shí)驗(yàn)前7 d開始灌胃給藥，術(shù)后12 h繼續(xù)給藥，每日1次，直至處死。給藥劑量按鼠與人體表面積等效劑量折算，康腦液高、中、低劑量組分別為24、12、6 g/(kg·d)，尼莫地平組劑量為1 mg/(kg·d)，假手術(shù)組及模型組灌胃等體積蒸餾水。

1.2.2 制備模型 根據(jù)改良Longa方法，線栓經(jīng)右側(cè)頸外動(dòng)脈插線建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)法制作大腦缺血再灌注（I/R）模型，假手術(shù)組除不穿線外，其余操作同模型組及治療組。

1.2.3 大鼠神經(jīng)功能評分 參照Longa建立的神經(jīng)功能缺損程度的五級四分法評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行評分，分別于造模大鼠蘇醒時(shí)及I/R 24 h后進(jìn)行評分：0分，不出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)；1分，病灶對側(cè)前爪不能充分伸展；2分，行走時(shí)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜；4分，不能行走，意識喪失。評分1～3分的大鼠符合模型成功的標(biāo)準(zhǔn)，不符合者剔除。

1.2.4 原位雜交技術(shù)檢測Pi3k和Akt mRNA 分別于再灌注12、24、48、72、168 h，每組取6只大鼠，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心房，依次灌入生理鹽水約200 mL、4%多聚甲醛約200 mL前固定至肢體變硬，開顱取腦，于前囟前2 mm至前囟后3 mm切腦，切塊厚度5 mm，迅速置入0.1%DEPC處理的4%多聚甲醛中后固定2～4 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片5 μm。用原位雜交方法（按說明操作），檢測腦組織Pi3k和Akt mRNA表達(dá)。光鏡下在梗死周邊區(qū)隨機(jī)讀取6個(gè)互不重疊視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 與模型組比較，康腦液各劑量組、尼莫地平組神經(jīng)功能評分明顯降低(P＜0.05)；與尼莫地平組比較，康腦液高、中劑量組神經(jīng)功能評分降低(P＜0.05)，見表1。

Table 1 Neurological scores of different times ofcerebral I/R in rats表1 各組I/R大鼠不同時(shí)間神經(jīng)功能評分（n=30，分±s）

Table 1 Neurological scores of different times ofcerebral I/R in rats表1 各組I/R大鼠不同時(shí)間神經(jīng)功能評分（n=30，分±s）

＊＊P＜0.01；a與(2)比較,b與(6)比較,P＜0.05

組別假手術(shù)組(1)模型組(2)康腦液高劑量組(3)康腦液中劑量組(4)康腦液低劑量組(5)尼莫地平組(6) F大鼠蘇醒時(shí)-2.03±0.61 1.47±0.51ab 1.50±0.51ab 1.77±0.43a 1.73±0.45a 6.177＊＊再灌注24 h -2.27±0.52 1.50±0.51ab 1.57±0.50ab 1.93±0.52a 1.87±0.57a 10.338＊＊

2.2 腦組織Pi3k mRNA與Akt mRNA原位雜交結(jié)果 見表2、3，圖1、2。Pi3k mRNA與Akt mRNA陽性表達(dá)可見胞漿呈棕黃色，與假手術(shù)組相比，模型組Pi3k mRNA與Akt mRNA表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)明顯增高(P＜0.05)。與模型組比較，康腦液各劑量組、尼莫地平組Pi3k mRNA與Akt mRNA的表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)明顯增高(P＜0.05)；尼莫地平組Pi3k mRNA與Akt mRNA表達(dá)低于康腦液高、中劑量組(P＜0.05)。

Table 2 Comparison of Pi3k mRNA expression level in cerebral tissue between six groups表2 各組大鼠腦組織Pi3k mRNA的比較(n=6，個(gè)數(shù)/視野，±s)

Table 2 Comparison of Pi3k mRNA expression level in cerebral tissue between six groups表2 各組大鼠腦組織Pi3k mRNA的比較(n=6，個(gè)數(shù)/視野，±s)

＊＊P＜0.01；a與(1)比較，b與(2)比較，c與(6)比較,P＜0.05，表3同

3.83±0.98 18.17±0.75a 25.67±0.52bc 25.33±0.82bc 22.33±0.52b 22.67±0.82b 714.000＊＊3.33±1.03 21.83±0.75a 29.17±1.33bc 28.83±0.98bc 24.83±0.98b 25.33±0.82b 558.444＊＊組別假手術(shù)組(1)模型組(2)康腦液高劑量組(3)康腦液中劑量組(4)康腦液低劑量組(5)尼莫地平組(6) F 48 h 2.83±0.75 18.33±0.52a 31.50±1.22bc 31.67±0.82bc 26.83±0.98b 27.50±0.84b 942.229＊＊72 h 2.17±0.75 16.17±0.41a 40.00±0.63bc 39.83±0.75bc 31.17±1.33b 32.00±1.10b 1712.629＊＊168 h 2.17±0.75 13.83±0.75a 37.17±0.75bc 37.17±0.75bc 30.00±0.63b 30.83±0.75b 1983.459＊＊

Table 3 Comparison of Akt mRNA expression in cerebral tissue between six groups表3 各組大鼠腦組織Akt mRNA的比較(n=6，個(gè)數(shù)/視野，±s)

Table 3 Comparison of Akt mRNA expression in cerebral tissue between six groups表3 各組大鼠腦組織Akt mRNA的比較(n=6，個(gè)數(shù)/視野，±s)

組別假手術(shù)組(1)模型組(2)康腦液高劑量組(3)康腦液中劑量組(4)康腦液低劑量組(5)尼莫地平組(6) F 12 h 4.00±0.89 13.67±1.21a 27.17±0.75bc 26.67±1.03bc 21.83±1.17b 23.00±0.89b 477.143＊＊24 h 3.67±0.82 17.00±1.26a 32.00±1.10bc 32.00±0.63bc 25.50±0.84b 26.17±0.75b 824.156＊＊組別假手術(shù)組(1)模型組(2)康腦液高劑量組(3)康腦液中劑量組(4)康腦液低劑量組(5)尼莫地平組(6) F 48 h 3.50±0.84 20.17±0.75a 36.50±1.05bc 36.67±0.52bc 26.50±0.55b 27.00±0.89b 1 466.107＊＊72 h 3.33±1.03 22.83±0.75a 39.00±0.89bc 38.67±0.82bc 30.00±0.63b 30.33±1.03b 1 382.577＊＊168 h 3.17±0.75 19.33±0.82a 35.83±0.75bc 35.67±0.52bc 28.00±0.63b 28.67±0.82b 1 751.702＊＊

Figure 1 Comparison of Pi3k mRNA expression in cerebral tissue between six groups(In situ hybridization，×400)圖1 大鼠腦組織Pi3k mRNA的表達(dá)(原位雜交，×400)

Figure 2 Comparison of Akt mRNA expression in cerebral tissue between six groups(In situ hybridization,×400)圖2 大鼠腦組織Akt mRNA的表達(dá)(原位雜交，×400)

3 討論

ICVD的發(fā)病基礎(chǔ)是腦組織缺血而導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)功能缺損，其治療關(guān)鍵無疑是改善缺血區(qū)的血供，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。有研究表明保證缺血區(qū)血流灌注可加速卒中后突觸的可塑性和功能的恢復(fù)[4]。臨床上超早期行重組組織型纖溶酶原激活劑(r-tPA)溶栓對ICVD的療效，證實(shí)了盡快恢復(fù)缺血區(qū)的血供，可減輕神經(jīng)功能的損害。

Pi3k/akt通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞生長、增殖等多種生物學(xué)行為的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Pi3k是磷脂激酶家族中的重要成員，由催化亞單位P110和調(diào)節(jié)亞單位P85組成異源二聚體，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性。Akt屬絲/蘇氨酸激酶家族，是Pi3k信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的下游靶激酶，具有絲/蘇氨酸激酶活性。生長因子與細(xì)胞膜受體結(jié)合后激活Pi3k，進(jìn)而激活下游蛋白如Akt,最終活化和上調(diào)cyclinD1，引起細(xì)胞增殖[5]。于惠賢等[6]研究表明Pi3k/akt通路的磷酸化參與血管新生，增加腦缺血區(qū)微血管密度，從而改善大腦血液循環(huán)，達(dá)到腦保護(hù)的作用。周賽君等[7]研究表明高糖可經(jīng)上調(diào)猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A細(xì)胞內(nèi)Pi3k/akt信號通路促進(jìn)血管新生。另外內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移也與Pi3k/akt通路有關(guān)[8-9]。且早有研究表明Pi3k/akt通路是促進(jìn)細(xì)胞存活的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]，Pi3k通過3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)磷酸化Akt使其活性增強(qiáng)，影響下游凋亡相關(guān)蛋白如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)等,發(fā)揮抗凋亡等作用[11]，保護(hù)神經(jīng)元。本研究顯示Pi3k/akt通路在I/R大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)中起到十分重要的作用。

康腦液由補(bǔ)陽還五湯化裁而來，具有益氣活血化瘀、清熱平肝、熄風(fēng)定驚的作用。諸多研究已證實(shí)益氣活血化瘀通絡(luò)法治療腦梗死具有明確療效[12-13]。本研究結(jié)果表明康腦液治療組，尤其高、中劑量治療組I/R大鼠的神經(jīng)功能明顯改善。與假手術(shù)組相比，模型組Pi3k mRNA與Akt mRNA的表達(dá)明顯增高，表明缺血影響了Pi3k/akt通路，對腦卒中的恢復(fù)起到一定作用，但用藥組較模型組更進(jìn)一步提高了Pi3k mRNA與Akt mRNA的表達(dá)，且康腦液高、中劑量治療組Pi3k mRNA與Akt mRNA的表達(dá)明顯增高，說明康腦液治療ICVD的可能機(jī)制之一是通過上調(diào)Pi3k/akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)。

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