內(nèi)生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑的研制

李舒雯， 周金偉， 易有金＊， 柏連陽(yáng)， 曹 熙

（1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

我國(guó)每年使用大量的化學(xué)農(nóng)藥制劑，容易造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)，生物富集，不僅污染生態(tài)環(huán)境，還影響人類(lèi)的健康［1－2］。生物農(nóng)藥副作用小、對(duì)人無(wú)害，是一種具有廣闊前景的綠色農(nóng)藥［3］，日益成為全球農(nóng)藥發(fā)展的一種趨勢(shì)［4］。

近年來(lái)研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)許多植物病原生物具有良好的抑制作用［5－8］，內(nèi)生細(xì)菌的研究已成為植物病害生物防治的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本研究從煙草植物組織中分離得到一株內(nèi)生抗菌細(xì)菌011，經(jīng)鑒定其為短短芽胞桿菌［Brevibacillus brevis（Migula）Shida et al．］，Gen Bank登錄號(hào)為 DQ444285［9］。011菌不僅對(duì)煙草青枯病具有良好的防治效果［9］，而且其發(fā)酵濾液還對(duì)8種植物病原真菌都有抑制作用，其中對(duì)番茄早疫病菌菌絲及孢子均有致畸作用，對(duì)番茄早疫病菌最低抑菌濃度MIC為30%，有效抑菌中濃度EC50為9．64%［10］，具有很大的生防開(kāi)發(fā)潛力。

目前常規(guī)化學(xué)殺菌劑防效低，污染環(huán)境，而開(kāi)發(fā)活體微生物可濕性粉劑在現(xiàn)代農(nóng)藥制劑中有廣泛的適用范圍［11－14］。本研究旨在研制短短芽胞桿菌011可濕性粉劑，確定其制劑成分，為開(kāi)發(fā)高效低毒活體微生物殺菌制劑提供基礎(chǔ)，符合現(xiàn)代社會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及有害生物綜合防治（IPM）的要求。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

內(nèi)生短短芽胞桿菌011菌株（Brevibacillus brevis）由湖南省食品科學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定與保存。供試?yán)苯芬卟【≒hytophthor a capsici Leonian）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1．1．2 培養(yǎng)基

BPY液體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基［15］。

1．1．3 供試試劑

載體：膨潤(rùn)土、滑石粉、高嶺土、硅藻土、白炭黑。

助劑：十二烷基苯磺酸鈉（DBS）、聚乙二醇（PEG8000）、吐溫－60、木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈣、羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）。

保護(hù)劑：抗壞血酸（VC）、糊精、十二烷基苯磺酸鈉（SDS）。

穩(wěn)定劑：碳酸鈣、磷酸氫二鉀、羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）。

1．2 方法

1．2．1 內(nèi)生短短芽胞桿菌011發(fā)酵制備

種子液制備：用接種環(huán)挑取斜面保存的011菌株，接入BPY液體培養(yǎng)基中，裝液量100 mL／250 mL，初始p H6．8，30℃，搖床180 r／min振蕩培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將以1%（V／V）接種量接入裝液量100 mL／250 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)60 h，搖床轉(zhuǎn)速為180 r／min。芽胞含量≥4．0×1011，芽胞率≥90%。

1．2．2 檢測(cè)方法

采用平板菌落計(jì)數(shù)法，測(cè)定制劑的芽胞含量。

按照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)內(nèi)生菌短短芽胞桿菌011可濕性粉劑進(jìn)行測(cè)定。潤(rùn)濕時(shí)間測(cè)定參照GB／T 5451－2001，懸浮率測(cè)定參照 GB／T 14825－2006，細(xì)度測(cè)定參照 GB／T 16150－1995，p H 測(cè)定參照 GB／T 1601－1993，加速貯存試驗(yàn)按GB／T 19136－2003。

1．2．3 制劑加工工藝

將內(nèi)生短短芽胞桿菌011搖瓶發(fā)酵液與載體按一定比例混合制成母液，鼓風(fēng)干燥60℃烘干，研磨制成母粉。在母粉中添加一定比例的分散劑、濕潤(rùn)劑、穩(wěn)定劑等，經(jīng)噴霧干燥進(jìn)風(fēng)溫度175℃，出風(fēng)溫度60℃制成可濕性粉劑。

1．2．4 初始制劑成分配比

發(fā)酵液70%，載體10%，助劑10%，穩(wěn)定劑2%，保護(hù)劑0．1%，白炭黑補(bǔ)足至100%。

1．2．5 載體的篩選

菌株發(fā)酵為液態(tài)，選擇膨潤(rùn)土、滑石粉、高嶺土、硅藻土、白炭黑不同材料做載體，檢測(cè)均勻母粉的濕潤(rùn)性、重量懸浮率，用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定各制劑的芽胞含量，比較各載體制劑松散性、成本等方面因素，選擇最優(yōu)載體。

1．2．6 助劑篩選及復(fù)配助劑配比確定

在所制成的母粉中，分別添加10%的助劑，噴霧干燥加工成制劑，測(cè)定各制劑的潤(rùn)濕時(shí)間，時(shí)間越短其潤(rùn)濕性越好；比較各制劑懸浮率的差異，懸浮率越高，分散性越好；測(cè)定芽胞含量，根據(jù)結(jié)果篩選出最佳潤(rùn)濕劑、分散劑。

從助劑中篩選出懸浮性較高，潤(rùn)濕性較好的助劑。按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的質(zhì)量比經(jīng)粉碎機(jī)混合均勻，噴霧干燥制成可濕性粉劑，測(cè)定其懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間，選擇出復(fù)配助劑的最佳質(zhì)量配比。

1．2．7 穩(wěn)定劑的篩選

將篩選出的填料、發(fā)酵液、濕潤(rùn)劑及分散劑分別與待選穩(wěn)定劑（2%）混合均勻后噴霧干燥加工成可濕性粉劑，以不加穩(wěn)定劑的為對(duì)照。加速貯藏穩(wěn)定性：進(jìn)行熱貯（54±2）℃，14 d后測(cè)定芽胞存活率。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1．2．8 保護(hù)劑的篩選

將篩選出的填料、發(fā)酵液、濕潤(rùn)劑及分散劑分別與待選保護(hù)劑（0．1%）加工成可濕性粉劑，以不加保護(hù)劑為對(duì)照，稀釋后涂布在平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，在距離254 n m紫外燈（20 W）40 c m處照射12、24 h后，計(jì)算芽胞存活率。

1．2．9 制劑穩(wěn)定性測(cè)定

取100 g內(nèi)生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑置于（4±2）℃和室溫（25℃）條件下貯存，每10 d測(cè)定樣品的芽胞含量，測(cè)定11次，確定制劑貯存期間芽胞含量的變化。

2 結(jié)果與分析

2．1 載體的篩選

載體在可濕性粉劑中占較大比例，因此載體的潤(rùn)濕性和懸浮率對(duì)制劑的潤(rùn)濕性和懸浮率影響大。由表1可知：各制劑的潤(rùn)濕時(shí)間均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。各載體親水性較強(qiáng)且表面積大，導(dǎo)致吸水性強(qiáng)。其中滑石粉制劑的濕潤(rùn)時(shí)間為10 s。不同材質(zhì)的載體顆粒不同，故懸浮率有差異。膨潤(rùn)土、硅藻土制劑懸浮率分別為60%、68%，均低于標(biāo)準(zhǔn)，高嶺土、滑石粉、白炭黑所制成的制劑懸浮率≥70%，具有較好的懸浮率，適用于本研究制劑的開(kāi)發(fā)。將制備的各制劑于室溫（25℃）貯藏14 d后測(cè)定活芽胞含量。綜合考慮各制劑懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間、價(jià)格等因素，篩選出最適載體。其中滑石粉制劑，芽胞含量貯存后有2．16×109cf u／g，高于其他載體制劑。

表1 載體對(duì)制劑理化性質(zhì)的影響Table 1 Effects of filler on wettable powder

2．2 助劑篩選

將待選助劑（10%）與已選定的載體、發(fā)酵液混合均勻后噴霧干燥加工成可濕性粉劑，測(cè)定潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率及芽胞含量，篩選出最佳助劑。由表2可知：雖吐溫－60潤(rùn)濕時(shí)間短，但懸浮率僅為44%；而以CMC－Na為分散劑時(shí)，制劑的懸浮率高，但其潤(rùn)濕時(shí)間長(zhǎng)達(dá)293 s。而以木質(zhì)素磺酸鈣為分散劑，其懸浮率高，可達(dá)74%，十二烷基苯磺酸鈉作為潤(rùn)濕劑，其潤(rùn)濕時(shí)間最短，為4 s。因此，選擇木質(zhì)素磺酸鈣與十二烷基苯磺酸鈉復(fù)配，篩選出最佳復(fù)配比例。

表2 助劑對(duì)制劑理化性質(zhì)的影響Table 2 Effects of additives on wettable powder

由表3可知：分散劑的含量逐步增加時(shí)，其懸浮率升高；而潤(rùn)濕時(shí)間來(lái)看，隨著潤(rùn)濕劑的減少，其潤(rùn)濕時(shí)間逐漸增長(zhǎng)。當(dāng)比例為7∶3時(shí)，011菌可濕性粉劑懸浮率為81%，潤(rùn)濕時(shí)間17 s達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，兼顧成本故確定木質(zhì)素磺酸鈣－十二烷基苯磺酸質(zhì)量比為7∶3。

2．2．1 穩(wěn)定劑的篩選

穩(wěn)定劑能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定制劑的理化性質(zhì)，還能提高制劑的滲透性，保證制劑在一定時(shí)期內(nèi)芽胞含量穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4：在3種穩(wěn)定劑中，羧甲基纖維素鈉作為穩(wěn)定劑，熱貯后芽胞存活率高達(dá)54%，而對(duì)照芽胞存活率僅為37%。

表4 穩(wěn)定劑對(duì)制劑熱貯的影響Table 4 Effects of stabilizer on wettable powder

表5 保護(hù)劑對(duì)制劑的影響Table 5 Effects of UV protective agenton wettable powder

2．2．2 保護(hù)劑的篩選

UV保護(hù)劑能將陽(yáng)光中的大部分紫外輻射吸收掉，將吸收的能量轉(zhuǎn)化為無(wú)害的熱能散發(fā)到空氣中，從而保護(hù)制劑達(dá)到所需要的效果。由表5可知：選用糊精為011菌可濕性粉劑UV保護(hù)劑時(shí)，紫外照射12、24 h，芽胞存活率均高出VC和SDS，分別達(dá)64%、42%，故選糊精為UV保護(hù)劑。

2．3 011菌可濕性粉劑穩(wěn)定性測(cè)定

內(nèi)生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑在25℃室溫、（4±2）℃下貯存100 d芽胞含量變化見(jiàn)圖1。由圖1可知，內(nèi)生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑在室溫25℃下貯藏芽胞存活率明顯低于（4±2）℃溫度。011菌在（4±2）℃貯藏100 d，其芽胞存活率可達(dá)90%，而在室溫貯藏100 d其芽胞存活率僅為72%。因芽胞桿菌在低溫處于休眠狀態(tài)，易于保存。

圖1 011菌可濕性粉劑貯藏期芽胞存活率變化Fig．1 Change of spore survival rate in strain 011 wettable powder during storage

2．4 制劑指標(biāo)

根據(jù)對(duì)內(nèi)生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑填料、助劑等篩選試驗(yàn)，確定了內(nèi)生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑最佳配方：滑石粉10%，木質(zhì)素磺酸鈣7%，DBS3%，CMC－Na2%，糊精0．1%。按照中華人民共和國(guó)農(nóng)藥相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示制備的內(nèi)生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑在25℃室溫下芽胞含量為1．8×1010cfu／g，p H6．8，懸浮率76%，潤(rùn)濕時(shí)間52 s，細(xì)度通過(guò)率98%，制劑貯藏100 d存活率達(dá)72%。

3 討論

生防菌的芽胞存活力是決定其最終防效的因素之一［16］，選擇適合的載體和助劑時(shí)，含芽胞數(shù)量成為衡量可濕性粉劑最佳配方的首要因素。因暫無(wú)短短芽胞桿菌可濕性粉劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，參照2013年實(shí)施的《中華人民共和國(guó)農(nóng)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY／Y2293．2－2012》，枯草芽胞桿菌可濕性粉劑含胞量指標(biāo)≥1．0×1010cf u／g，研制的短短芽胞桿菌011可濕性粉劑芽胞含量為1．8×1010cf u／g，符合參照枯草芽胞桿菌可濕性粉劑含胞量行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

載體在可濕性粉劑中占有較大比例，因此載體的潤(rùn)濕性和懸浮率對(duì)制劑的潤(rùn)濕性和懸浮率有主要影響。本研究表明芽胞在滑石粉載體中含量穩(wěn)定，吸附量大，故選取滑石粉為制劑載體。李慧［17］等研究表明，滑石粉可以降低外界不良因素對(duì)活菌體的損害，還能使菌體吸附于載體上，具有一定的緩釋效果，在貯藏期內(nèi)菌體釋放率較高，菌劑中活菌數(shù)保持在1010～1011數(shù)量級(jí)，同時(shí)通過(guò)電鏡觀(guān)察，片層狀的滑石粉為細(xì)菌菌株提供了豐富的吸附位點(diǎn)。Jayaraman［18］等將滑石粉用作微生物農(nóng)藥的主要添加劑。助劑不僅可以提高防效，延長(zhǎng)貨架期，還能降低成本［19］。篩選的羧甲基纖維素鈉是一種黏附劑，此類(lèi)高分子物質(zhì)，具有黏附作用和使藥液黏稠，故有利于芽胞生存，抵抗惡劣環(huán)境，又因羧甲基纖維素鈉具有吸濕性及分散性，還能提高011菌可濕性粉劑濕潤(rùn)性及分散性，故選羧甲基纖維素鈉為穩(wěn)定劑。

開(kāi)發(fā)活體微生物殺菌劑不僅提高了農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)效益，又能保護(hù)生態(tài)環(huán)境。本研究短短芽胞桿菌011對(duì)多種植物病原菌具有很好的抑菌效果，制備的內(nèi)生短短芽胞桿菌011可濕性粉劑，迄今文獻(xiàn)中未見(jiàn)研究報(bào)道。為下一步開(kāi)發(fā)短短芽胞桿菌可濕性粉劑的配方篩選奠定了基礎(chǔ)。

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