藥劑學專業(yè)本科生藥物動力學實驗方法的改進

陳 鈞，王建新

（復(fù)旦大學 藥學院，藥劑學教研室，上海 201203）

藥劑學專業(yè)本科生藥物動力學實驗方法的改進

陳 鈞，王建新

（復(fù)旦大學 藥學院，藥劑學教研室，上海 201203）

設(shè)計了本科生藥物動力學實驗，探討了該實驗的可行性，并對測定方法進行了方法學驗證，證明該實驗樣品預(yù)處理簡便，測定方法具有較好的專屬性、線性、準確度、回收率和精密度。與原先設(shè)計的實驗相比，本實驗可操作性強，測定藥動學參數(shù)準確，可以替代原先藥動學實驗設(shè)計從而提高實驗教學效果。

高效液相色譜法；頭孢丙烯；學生實驗

藥物動力學是定量研究藥物及制劑在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程動態(tài)變化規(guī)律的一門科學，對于新藥研發(fā)、藥物新劑型和新制劑設(shè)計、藥物療效和不良反應(yīng)監(jiān)測以及臨床合理應(yīng)用均具有重要指導意義。藥物動力學實驗是藥動學理論與實踐密切相結(jié)合的重要組成部分，能使學生鞏固課堂教授的理論知識，提高動手能力，培養(yǎng)嚴謹?shù)莫毩⑺伎己徒鉀Q問題的能力，對于提高學生的藥學專業(yè)素質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。原來本實驗課程選用的實驗是“血藥濃度法測定家兔口服阿司匹林混懸劑和片劑后的藥動學參數(shù)”，該實驗存在以下問題：

1.所測定的阿司匹林的代謝物水楊酸的半衰期為5～8小時，根據(jù)藥動學取樣設(shè)計的指導原則，取樣持續(xù)時間應(yīng)該至少為3～5個半衰期，即最終取樣持續(xù)時間應(yīng)該至少為給藥后24小時，這對于學生實驗來說是非常不方便的。

2.樣品處理和測定的方法為將血漿中水楊酸衍生化后再用有機溶劑提取，隨后采用熒光分光光度檢測方法。該樣品處理方法較為繁瑣，在處理過程中樣品容易發(fā)生乳化而導致樣品損失；另外由于采用測定的方法為熒光分光光度法，此方法并不具備色譜分離的功能，導致測定方法的專屬性不高，準確度差，測得的血藥濃度數(shù)據(jù)進一步進行藥動學參數(shù)計算時存在很大誤差，導致實驗結(jié)果不可靠?；诖?，我們對本科生的藥動學實驗進行改革，將實驗改為“血藥濃度法測定家兔口服頭孢丙烯膠囊劑和片劑后的藥動學參數(shù)”，采用頭孢丙烯為實驗藥物，并且建立了操作簡單的有機溶劑沉淀法處理家兔血漿樣品并采用高效液相（HPLC）-紫外檢測器測定血漿中頭孢丙烯的測定方法。我們將該方法應(yīng)用于學生實驗，使實驗取樣時間大大縮短，預(yù)處理方法簡單，更重要的是所測得的藥動學參數(shù)更加準確，取得較好的教學效果。

一、實驗內(nèi)容

1.實驗藥物。實驗制劑1：頭孢丙烯膠囊；規(guī)格：每粒含頭孢丙烯250mg；生產(chǎn)廠家：上海普康藥業(yè)有限公司。實驗制劑2：頭孢丙烯片；規(guī)格：每片含頭孢丙烯250mg；生產(chǎn)廠家：中美上海施貴寶制藥有限公司

2.實驗動物：家兔（性別：雌雄不限，體重2-3Kg左右，同一批家兔體重差異最好不超過0.2kg—0.3kg）

3.實驗方法。①給藥方案。a.家兔采血方法及血樣保存：家兔實驗前禁食一天，采血前將其放入兔箱中，待安靜后，剪去耳緣側(cè)兔毛，暴露家兔耳緣靜脈，用酒精棉球擦拭兔耳緣使血管充盈，選取兔近耳尖耳緣靜脈血流交匯處切一小口，干棉球擦拭，滴取空白血約0.5～1.0ml于預(yù)加肝素試管中，2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層約0.2～0.4ml血漿于離心管中，-18℃冰箱保存。b.家兔口服片劑或者膠囊（2片或2粒）：一同學將坩堝鉗橫插于家兔口內(nèi)，翻轉(zhuǎn)，將舌頭壓在坩堝鉗下，另一同學用鑷子夾住片劑，從坩堝鉗的孔中水平送入至咽部，用鑷子將片子塞入，片子落入食管，然后用注射針筒灌胃，緩慢給予家兔溫水20ml。c.定時采血：兩種制劑給藥后，分別于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6小時取血約0.5～1.0ml于預(yù)加肝素試管中，2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層約0.3～0.5ml血漿于離心管中，-18℃冰箱保存。②血樣測定。a.色譜儀器。日本島津公司高效液相色譜儀，包括LC-10AT VP泵，SPD-10A VP型紫外檢測器，CTO-10A柱溫箱及杭州英譜公司HS2000色譜工作站b.色譜條件。色譜柱：采用DIKMAC18色譜柱（200×4.6mm，5μm）；流動相：0.1%三氟乙酸（用三乙胺調(diào)至pH2.3）：甲醇＝75：25；流速：1.2ml/min；柱溫：40℃；紫外檢測波長：280 nmc.標準曲線的制備。精密稱取頭孢丙烯標準品一定量，用水配制成1mg/ml的標準溶液。分別精移取標準溶液適量，用水稀釋至含頭孢丙烯1，5，10，50，100，200，500μg/ml，分別精密取上述溶液10μl，加入90μl空白兔血漿，然后加入300 μl甲醇（用于沉淀蛋白），渦旋混合10秒，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液100 μl，然后加蒸餾水100 μl，渦旋混合10秒，微量進樣器進樣20 μl，采用高效液相-紫外檢測，記錄峰面積（A），建立A對C（濃度）的標準曲線方程。d.血漿樣品的處理與測定?？瞻籽獫{或樣品血漿室溫下解凍，待融化后，精密移取100 μl，加入300 μl甲醇，渦旋混合10秒，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液100 μl，然后加蒸餾水100 μl，渦旋混合10秒，微量進樣器進樣20 μl，記錄峰面積（A）。將測得峰面積帶入標準曲線方程，采用外標法計算血漿樣品中頭孢丙烯濃度。

二、實驗結(jié)果

1.專屬性考察：在此色譜條件下，頭孢丙烯與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)均完全分離，峰形尖銳，其保留時間約為9.5分鐘，其他均為內(nèi)源性雜質(zhì)?？疾炝?份不同來源的家兔血漿，在所建立的HPLC條件下，血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾頭孢丙烯的測定，其典型色譜圖見圖1。

圖1 HPLC分析典型圖譜

2.標準曲線的線性：以藥物與內(nèi)標峰面積比值（Y）對藥物濃度（C，μg/ml），用線性回歸方法擬合標準曲線（加權(quán)系數(shù)為1/C），結(jié)果如下：Y=9876C-243（r=0.9999，n=6），線性范圍：0.1～50μg/ml。

3.提取回收率。取空白兔血漿0.5 ml數(shù)份，分別加入頭孢丙烯標準溶液使血漿中頭孢丙烯的濃度分別為0.1，5，50μg/ml，按血樣預(yù)處理方法處理后作HPLC分析，記錄峰面積（A1）。另取0.1，5，50μg/ml頭孢丙烯標準液，按照血樣預(yù)處理方法處理后作HPLC分析，記錄峰面積（A2），由兩者的比值計算提取回收率，經(jīng)測定高中低個濃度的提取回收率在93.07%～99.14%之間，符合提取回收率的要求。

4.方法回收率。取空白兔血漿0.5ml數(shù)份，分別加入頭孢丙烯標準溶液，使血漿中頭孢丙烯的濃度分別為0.1，5，50μg/ml，每一濃度配制5份樣品，按血樣預(yù)處理方法處理后作HPLC分析。將測得的濃度與樣品配制的濃度相比，得方法回收率。經(jīng)測定，高中低濃度的測定值在96.95%～99.92%之間，符合方法回收率的測定要求。

5.批內(nèi)、批間精密度。配制0.1，5，50μg/ml的標準血樣各5管，于同一天以一個批次按血樣預(yù)處理方法處理后作HPLC分析，計算測定數(shù)據(jù)的相對標準差，即為批內(nèi)精密度。以后連續(xù)測定5天，每天以一個批次測定上述濃度的樣品，計算批間精密度。結(jié)果批內(nèi)精密度和批間精密度均小于3.13%，符合精密度的測定要求。

三、討論

1.實驗藥物的選擇。經(jīng)文獻查閱，頭孢丙烯在體內(nèi)的半衰期為1～2小時，達峰時間約為1.5小時。根據(jù)藥動學實驗設(shè)計原則，取樣時間應(yīng)為3～5個半衰期，因此本實驗的取樣時間為6小時即可，比原先實驗需要24小時的取血時間大為縮短，實際操作性好。

2.樣品預(yù)處理方法的選擇。本實驗的樣品預(yù)處理方法為沉淀蛋白法，操作極為簡單，引入誤差小，樣品的取用量少。而原先樣品預(yù)處理方法為衍生化后有機溶劑提取法，該方法操作繁瑣，在處理過程中樣品容易發(fā)生乳化而導致樣品損失；另外該方法的血漿樣品取用量大，實際操作性差。

3.測定方法的選擇。本實驗中我們開發(fā)了測定家兔血漿中頭孢丙烯的高效液相色譜測定方法，該方法靈敏、專屬、準確性高，藥動學參數(shù)測定準確。原先實驗設(shè)計的測定的方法為熒光分光光度法，此方法并不具備色譜分離的功能，導致測定方法的專屬性不高，準確度差，測得的血藥濃度數(shù)據(jù)進一步進行藥動學參數(shù)計算時存在很大誤差，導致實驗結(jié)果不可靠。

經(jīng)本校2011、2012級本科生的實驗教學證明，該實驗方法操作性強、實驗方法簡化、測定結(jié)果準確，達到了較好的實驗教學目的。

[1]唐建國.口服頭孢菌素——頭孢丙烯[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，1998，（19）：350–357.

[2]Park TH，KimJK，Jee JP，Park JS，Kim CK.HPLC method for simultaneous determination of cefprozil diastereomers in human plasma[J].J Pharm Biomed Anal，2004，（36）：243–248.

[3]袁成，王景祥.頭孢炳烯在健康志愿者和呼吸系統(tǒng)感染患者的藥物動力學[J].中國臨床藥學雜志，1998，（7）：15–18.

[4]張菁，曹憶堇，郁繼誠，施耀國，張嬰元.頭孢炳烯臨床藥代動力學和干混懸劑與片劑的生物等效性[J].中國抗感染化療雜志，2001，（1）：87–88.

[5]高磊，張撲，劉艷，肖永紅.頭孢炳烯臨床藥代動力學及藥效學研究[J].中國抗感染化療雜志，2003，（3）：214–216.

[6]國家藥典委員會.中國藥典（2010年版）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

G642.0

A

1674-9324（2014）42-0279-03

陳鈞，男，副教授，博士生導師，復(fù)旦大學藥學院，藥劑學教研室。

王建新，男，教授，博士生導師，復(fù)旦大學藥學院，藥劑學教研室。