吲哚美辛血漿樣品含量測定方法的建立

李 杰，宦 娣，余興群

吲哚美辛為非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥，具有抗炎、抗風濕、抗過敏、解熱、止痛等作用［1］。因其應用廣泛，目前已有各種吲哚美辛劑型上市，如滴眼劑、緩釋片、脂質體等。本文采用HPLC法，建立了測定吲哚美辛血漿樣品含量的方法，為進一步研究吲哚美辛的體內利用度奠定了一定的基礎。

圖1 IMC血漿樣品的高效液相色譜圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(四元泵、紫外檢測器、自動進樣器、Agilent化學工作站，美國Agilent公司);集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF－101S，鄭州長城科工貿有限公司);臺式微量高速離心機(H1650－W，長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 材料 吲哚美辛(indomethacin，IMC，純度＞99.5%);萘普生鈉對照品(含量99.9%，中國藥品生物制品檢定所);SD大鼠(250±20)g;甲醇(色譜純，天津市四友精細化學品研制有限公司);其余試劑都為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為 Platisil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm);Easy Guard預柱(4.6 mm ×10 mm);流動相為甲醇:0.4%冰醋酸(80:20，v/v);流速為 1.0 mL/min;柱溫為 30℃;檢測波長320 nm;進樣量10 μL。

2.2 血漿樣品的處理 大鼠禁食不禁水24 h后或非禁食，灌胃給 IMC 4.5 mg/kg分別于給藥前和給藥后 0.017、0.05、0.083、0.17、0.33、0.67、1、2、3、4、8、12、24 h，于眼底靜脈叢取血0.4 mL，置肝素處理的離心管中，13 000 r/min離心5 min，分離血漿，取0.15 mL，置－20℃冰箱保存。用前融化，加入內標萘普生鈉(200 mg/L)10 μL 混勻，pH7.0 PBS15 μL 和 20 mgNaCl渦旋混勻，加入乙酸乙酯375 μL渦旋混勻，離心10 000 r/min，取有機層，氮吹，50 μL甲醇富集離心進樣。

2.3 專屬性檢查 按照血漿樣品處理方法處理空白血漿，并以 上述色譜分析條件進樣。IMC、萘普生鈉的保留時間(tR)分別約為7.9和5.3 min，兩色譜峰均與血漿中內源性雜質分離良好，見圖1。

2.4 最低檢測限 同上述方法以稀釋IMC血樣，當信噪比S/N≥3時，為藥物的最低檢測限。結果測定IMC的最低檢測限為0.01μg/mL。

2.5 線性關系考察 標準儲備溶液配制:精密稱取IMC標準品2.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，即為200 μg/mL標準儲備溶液A;精密稱取IMC標準品1.0 mg，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，即為20 μg/mL標準儲備溶液B;精密稱取萘普生鈉標準品1.0 mg，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，即為20 μg/mL標準儲備溶液C。取10份空白血漿樣品150 μL，分別加入標準儲備溶液A、B、C，依照樣品處理方法處理，將其配制成一系列濃度為 0.12、0.24、0.49、0.98、2.49、4.98、9.96、19.92、24.90、37.36 μg/mL 的樣品。按上述色譜條件進樣，以IMC與萘普生鈉的峰面積比值A測/A內對IMC的濃度C(x)進行線性回歸，制得血漿中IMC含量的標準曲線，以1/c2 加權得標準曲線為 Y=0.30843X+0.31365(r=0.99955，n=10)。

結果表明，IMC 濃度在 0.12 ～37.36 μg/mL 范圍內，IMC與萘普生鈉的峰面積比值A測/A內與IMC的濃度C(x)具有良好的線性關系。

2.6 穩(wěn)定性考察 將加入低、中、高3個濃度IMC的血漿樣品分別置于－85℃，－20℃冰箱及室溫中存放，定期取樣測定;另外將低、中、高3個濃度IMC的血漿樣品，置于－20℃冰箱中冷凍24 h后取出以及反復凍融3次，以考察藥物的穩(wěn)定性。

結果顯示，血漿樣品在－85℃的冰箱中保存45 d基本穩(wěn)定，－20℃的冰箱中保存30 d基本穩(wěn)定，放置于室溫下12 h基本穩(wěn)定。另外將低、中、高3個濃度IMC的血漿樣品，置于－20℃冰箱中冷凍24 h后取出以及反復凍融3次，血漿樣品基本穩(wěn)定。

2.7 精密度考察 取空白血漿3份各150 μL，分別加入標準儲備溶液A、B、C，按樣品處理方法處理配制成濃度為0.12、9.96、37.36 μg/mL 低、中、高 3 個血樣，3 批血樣平行測定 5份，計算日內精密度;并連續(xù)測定3天，計算日間精密度。IMC血漿樣品測定方法的精密度結果見表1。

結果表明，該方法日內精密度RSD＜5%，日間精密度RSD＜6%，可以滿足生物樣品分析要求。

表1 精密度試驗結果(±s，n=5)

表1 精密度試驗結果(±s，n=5)

?

2.8 回收率試驗

2.8.1 提取回收率 將純水加入到IMC，使其濃度與項“精密度”中血漿樣品相同，按血漿樣品處理操作，測定并計算高、中、低3個濃度血漿萃取回收率。各血漿樣品中IMC的提取回收率結果見表2。3種濃度IMC的平均提取回收率在84.51% ～91.68%范圍內，可以滿足生物樣品分析要求。

表2 血漿中吲哚美辛提取回收率(±s，n=5)

表2 血漿中吲哚美辛提取回收率(±s，n=5)

?

2.8.2 方法回收率 取空白血漿3份各150 μL，分別加入一定量的標準儲備溶液A、B，并按樣品處理方法處理配制成濃度為0.12、9.96、37.36 μg/mL 低、中、高 3 個血樣，測定含量并比較給藥量，計算方法回收率。各血漿樣品中IMC的方法回收率結果見表3。3種濃度IMC的平均方法回收率為98.96% ，標準差＜13%，可以滿足生物樣品分析要求。

表3 吲哚美辛方法回收率 (±s，n=5)

表3 吲哚美辛方法回收率 (±s，n=5)

?

3 結論

經查閱相關資料［2-4］，本文選擇了萘普生鈉為內標，甲醇和0.4%冰醋酸為流動相，并調節(jié)其比例為80:20，結果吲哚美辛在該色譜條件下與內標分離良好，專屬性佳。方法學試驗的考察結果，亦顯示本文建立的測定吲哚美辛血漿樣品含量測定的方法專屬性強，準確度高，適用于生物樣品的分析要求。

［1］孔令春.吲哚美辛的臨床應用進展［J］.海峽藥學，2006，18(2):116-118.

［2］徐軍輝，李存金，王仕平，等.中成藥中非法添加吲哚美辛檢測方法的研究［J］.中國藥事，2010，24(9):894-897.

［3］張福志，傅紅興，王和美，等.RP-HPLC法測定吲哚美辛在人工結腸液中的含量［J］.中國藥房，2011，22(20):1901-1903.

［4］張振波，周健鵬.RP-HPLC法測定吲哚美辛貼片中吲哚美辛的含量［J］.天津藥學，2011，23(4):9-10.