赤紅球菌CGMCC3090生物轉(zhuǎn)化肉桂腈合成肉桂酰胺的工藝

翟 瑩，申雁冰，湯 睿，鄭 宇，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

赤紅球菌CGMCC3090生物轉(zhuǎn)化肉桂腈合成肉桂酰胺的工藝

翟 瑩，申雁冰，湯 睿，鄭 宇，王 敏

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

針對目前肉桂酰胺工業(yè)生產(chǎn)采用的肉桂酸和二氯亞砜、濃氨水兩步化學(xué)反應(yīng)工藝存在安全性較低、產(chǎn)物分離純化困難等問題，建立并優(yōu)化了赤紅球菌CGMCC3090催化肉桂腈生成肉桂酰胺的轉(zhuǎn)化工藝．研究表明：底物肉桂腈濃度為1.5mol/L，赤紅球菌菌體質(zhì)量濃度為2.6g/L，在30℃、pH 7.5條件下，轉(zhuǎn)化5h后轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%，具有產(chǎn)物純度高、無副產(chǎn)物肉桂酸生成的優(yōu)勢，為赤紅球菌CGMCC3090生物轉(zhuǎn)化合成肉桂酰胺的工藝放大和生產(chǎn)性應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)．

赤紅球菌；生物轉(zhuǎn)化；肉桂酰胺；腈水合酶

腈水合酶是許多微生物催化腈化合物代謝的關(guān)鍵酶，具有化學(xué)、區(qū)域、立體選擇性，寬泛的底物特異性，能夠降解有毒腈類物質(zhì)或者代替化學(xué)方法生產(chǎn)酰胺藥物，并且已成功引入到化學(xué)工業(yè)中生產(chǎn)丙烯酰胺、煙酰胺和5–氰基戊酰胺等[1–10]．肉桂酰胺是一種重要的有機(jī)合成中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥合成及精細(xì)化工等領(lǐng)域，可作為害蟲的趨避劑，且對線蟲也有一定的抑制作用，可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，是一種具有開發(fā)前景的抗腫瘤化合物．肉桂酰胺的衍生物可作為腦神經(jīng)保護(hù)劑、受體拮抗劑等[11]．目前，工業(yè)上生產(chǎn)肉桂酰胺主要通過肉桂酸和二氯亞砜加熱生成肉桂酰氯，再通過濃氨水和肉桂酰氯反應(yīng)的二步反應(yīng)合成．該化學(xué)工藝存在安全性較低、對設(shè)備要求高、產(chǎn)物分離純化困難、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題[12]．

用微生物法代替化學(xué)法生產(chǎn)肉桂酰胺具有重要意義，許多研究者致力于生物法生產(chǎn)肉桂酰胺的研究．1970年，Bezanson等[13]利用Streptomyces vorticillatus ATCC13495所產(chǎn)苯丙氨酸脫氨酶生產(chǎn)肉桂酰胺，并采用14C標(biāo)記L–苯丙氨酸上的羧基碳進(jìn)行其代謝途徑的研究，發(fā)現(xiàn)在鏈霉菌ATCC13495菌株的代謝途徑中，L–苯丙氨酸部分生成肉桂酸，然后得到肉桂酰胺；L–苯丙氨酸為0.5g/L時，脫氨酶酶活性為210mU/g(DCW)．1986年，Prevatt等[14]報道了9株紅球菌可以將肉桂腈轉(zhuǎn)化為肉桂酰胺，但是有副產(chǎn)物肉桂酸的生成，增加了產(chǎn)物后續(xù)分離純化的困難．2004年，Brunati等[15]研究發(fā)現(xiàn)22株不同的放線菌可以將肉桂酸轉(zhuǎn)化為肉桂酰胺，其中Streptomyces halstedii對肉桂酸的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，底物質(zhì)量濃度為2g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)95%，其余菌株對0.3g/L肉桂酸的轉(zhuǎn)化率為20%～80%，產(chǎn)物得率較低，制約了生物途徑制備肉桂酰胺的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程．因此，迫切需要找到一種反應(yīng)條件溫和，生產(chǎn)條件及分離純化過程簡單的微生物方法代替化學(xué)生產(chǎn)方法．

本研究利用赤紅球菌(Rhodococcus ruber) CGMCC3090對肉桂腈進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生成肉桂酰胺．該菌株對肉桂腈具有較高的轉(zhuǎn)化能力，產(chǎn)物純度高，后續(xù)產(chǎn)品分離純化簡單．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

赤紅球菌(Rhodococcus ruber)CGMCC3090，本研究室自土壤中篩選獲得，現(xiàn)保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心．

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，pH 7.2．

種子培養(yǎng)基(g/L)：甘油10，蛋白胨5，麥芽浸粉3，酵母粉3，pH 7.0．

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，酵母粉5，尿素7，KH2PO40.5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，谷氨酸鈉 1，CoCl2·6H2O 2.38×10-2，pH 7.0．

1.1.3 主要試劑和儀器

肉桂腈、肉桂酰胺、肉桂酸，天津希恩思生化科技有限公司；蛋白胨、酵母粉，美國BD公司；1260型高效液相色譜儀(HPLC)，Agilent Technologies公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 赤紅球菌CGMCC3090菌體培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)：30℃恒溫培養(yǎng)4～5d．

種子培養(yǎng)：挑取經(jīng)斜面活化的赤紅球菌CGMCC3090菌種1環(huán)，接種于裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，180r/min、30℃培養(yǎng)28h．

發(fā)酵培養(yǎng)：按3%的接種量將種子培養(yǎng)液接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，180r/min、28℃培養(yǎng)48h．

1.2.2 赤紅球菌靜息細(xì)胞制備與肉桂腈轉(zhuǎn)化反應(yīng)

5,000r/min離心收集發(fā)酵培養(yǎng)的菌體，用KH2PO4–NaOH緩沖液(50mmol/L，pH 7.0)洗滌3次，制備赤紅球菌靜息細(xì)胞，將其懸浮于一定體積的緩沖液中，使A600＝0.7±0.02(稀釋50倍)．將終濃度為0.5mol/L的底物肉桂腈和9mL KH2PO4–NaOH緩沖液(50mmol/L，pH 7.0)加入100mL的三角瓶中，30,W超聲5min使底物分散均勻，30℃搖床保溫20min，加入終質(zhì)量濃度為0.7g/L的赤紅球菌菌懸液，30℃轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化實驗設(shè)定3個平行樣，下同)．按轉(zhuǎn)化時間取適量轉(zhuǎn)化液加入2倍體積乙酸乙酯萃取，取適量乙酸乙酯萃取液，揮發(fā)干后用甲醇重新溶解，經(jīng)0.22μm微孔膜過濾后用于TLC、HPLC分析．

1.3 分析方法

1.3.1 轉(zhuǎn)化樣品TLC檢測

將乙酸乙酯萃取液點樣于薄層層析硅膠板，以肉桂腈、肉桂酰胺標(biāo)準(zhǔn)品作對照，展開體系為V(氯仿)∶V(甲醇)＝9∶1，在紫外燈(254nm)下觀察赤紅球菌CGMCC3090能否轉(zhuǎn)化肉桂腈，初步判斷其轉(zhuǎn)化情況.

1.3.2 轉(zhuǎn)化率測定

采用高效液相色譜(HPLC)檢測轉(zhuǎn)化率．色譜柱為Phenomenex Luna C18(5μm，250mm×4.6mm)，流動相V(甲醇)∶V(水)＝8∶2，流量0.6mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃，檢測波長254nm．按式(1)計算摩爾轉(zhuǎn)化率．

式中：c0為轉(zhuǎn)化起始底物濃度，mol/L；c為轉(zhuǎn)化終止時底物濃度，mol/L．

1.4 肉桂腈轉(zhuǎn)化工藝的建立

1.4.1 轉(zhuǎn)化溫度的選擇

肉桂腈濃度為0.5mol/L，赤紅球菌菌體質(zhì)量濃度為0.7g/L，以50mmol/L的KH2PO4–NaOH緩沖液(pH,7.0)為反應(yīng)介質(zhì)，分別考察20、25、30、35、40℃下反應(yīng)4h的轉(zhuǎn)化率．

1.4.2 轉(zhuǎn)化pH的選擇

反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時間4h，分別考察pH在5～9區(qū)間變化時對反應(yīng)的影響．

1.4.3 底物濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

赤紅球菌菌體質(zhì)量濃度為2.6g/L，反應(yīng)溫度為30℃，pH為7.5，考察肉桂腈濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mol/L對反應(yīng)的影響．

1.4.4 菌體質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

底物肉桂腈濃度為1.5mol/L，反應(yīng)溫度為30℃，pH為7.5，分別加入1.3、2.0、2.3、2.6、3.0、3.3、4.0g/L的菌體，測定其對反應(yīng)的影響．

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂腈轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

轉(zhuǎn)化液樣品TLC檢測結(jié)果見圖1，底物肉桂腈Rfs和產(chǎn)物肉桂酰胺Rfp分別為0.8和0.3，說明底物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離效果較好．轉(zhuǎn)化液在薄層板上出現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物肉桂酰胺斑點，表明赤紅球菌CGMCC3090可以轉(zhuǎn)化肉桂腈生成目標(biāo)產(chǎn)物，而且轉(zhuǎn)化率較高(未見殘留的底物斑點)．

圖1 肉桂腈轉(zhuǎn)化液的TLC譜圖Fig. 1 TLC spectrum of cinnamonitrile biotransformation

進(jìn)一步采用HPLC分析方法分析其轉(zhuǎn)化情況，圖2是轉(zhuǎn)化4h時的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液的HPLC譜圖．

圖2 肉桂腈轉(zhuǎn)化液的HPLC譜圖Fig. 2 HPLC spectrum of cinnamonitrile transformation

由圖2可以看出，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為肉桂酰胺(保留時間6.1min)，底物肉桂腈(保留時間8.4min)基本被轉(zhuǎn)化完全，轉(zhuǎn)化率94.9%，沒有副產(chǎn)物肉桂酸(保留時間3.6min)的生成．

2.2 肉桂腈轉(zhuǎn)化工藝的確定

2.2.1 轉(zhuǎn)化溫度的選擇

溫度影響菌體細(xì)胞所產(chǎn)腈水合酶的活性、穩(wěn)定性及選擇性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率．已發(fā)現(xiàn)的腈水合酶的適宜溫度在10～45℃．溫度對赤紅球菌CGMCC3090轉(zhuǎn)化肉桂腈的影響如圖3所示．由圖3可知：溫度為30℃時肉桂酰胺轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，為94.9%；溫度為20℃和40℃時，轉(zhuǎn)化率仍保持在80%以上，說明赤紅球菌CGMCC3090所產(chǎn)腈水合酶的適宜溫度范圍較寬．這與來源于Rhodococcus rhodochrous IFO15564[16]的腈水合酶(最適反應(yīng)溫度為30～40℃)特性一致．

圖3 溫度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig. 3 Effect of temperature on transformation

2.2.2 轉(zhuǎn)化pH的選擇

pH影響微生物細(xì)胞酶分子的構(gòu)象，從而影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率．Kashiwagi等[16]報道Rhodococcusrhodochrous IFO15564所產(chǎn)腈水合酶的最適pH在7.0～8.5范圍內(nèi)．從圖4所示的pH對赤紅球菌CGMCC3090轉(zhuǎn)化肉桂腈的影響發(fā)現(xiàn)：其pH為7.5時肉桂酰胺的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，為97.2%；在酸性條件下，腈水合酶轉(zhuǎn)化能力較低，而偏弱堿性時，即pH 7～8時其轉(zhuǎn)化效率較高．

圖4 pH對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig. 4 Effect of pH on transformation

2.2.3 底物濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

Prevatt等[14]利用Rhodococcus所產(chǎn)腈水合酶將肉桂腈水解生成肉桂酰胺，底物濃度為5mmol/L，轉(zhuǎn)化23h后，肉桂酰胺的產(chǎn)率僅為40%，副產(chǎn)物肉桂酸的產(chǎn)率為57%，帶來目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化困難．赤紅球菌CGMCC3090能夠較好地催化肉桂腈，肉桂腈底物濃度對轉(zhuǎn)化過程的影響如圖5所示．由圖5可以看出：底物濃度為3.5mol/L時轉(zhuǎn)化速率較慢；當(dāng)初始肉桂腈濃度較低時(≤1.5mol/L)，轉(zhuǎn)化非常迅速，轉(zhuǎn)化5h，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)100%．可見，赤紅球菌CGMCC3090靜息細(xì)胞對底物肉桂腈的耐受性較高，易于實現(xiàn)高濃度的產(chǎn)物合成．

圖5 底物濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig. 5 Effect of initial substrate concentration on trans formation

2.2.4 菌體質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

初始肉桂腈底物濃度為1.5mol/L，不同菌體質(zhì)量濃度對肉桂酰胺轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的影響見表1，轉(zhuǎn)化速率隨著菌體質(zhì)量濃度的增加而提高．當(dāng)菌體質(zhì)量濃度為2.6g/L時，反應(yīng)5h時，肉桂酰胺轉(zhuǎn)化率為100%，無副產(chǎn)物肉桂酸產(chǎn)生．

表1 菌體質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Tab. 1 Effect of cell concentrations on transformation

圖6為赤紅球菌CGMCC3090靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化肉桂腈生成肉桂酰胺的過程曲線．反應(yīng)5h時，1.5mol/L肉桂腈轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，進(jìn)一步延長時間至8h，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物保持穩(wěn)定，未發(fā)生進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化衍生反應(yīng)，也未發(fā)現(xiàn)有腈水合酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)常伴隨出現(xiàn)的羧酸的生成．產(chǎn)物肉桂酰胺為白色固體，微溶于水，隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行，高濃度的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以固態(tài)形式從反應(yīng)液中析出，底物肉桂腈為淺黃色液體，不溶于水，表現(xiàn)出多相反應(yīng)特征．

圖6 赤紅球菌CGMCC3090轉(zhuǎn)化肉桂腈反應(yīng)過程曲線Fig. 6Course of cinnamonitrile transformation by R. ruber CGMCC3090

3 結(jié) 論

赤紅球菌CGMCC3090可以轉(zhuǎn)化肉桂腈生成肉桂酰胺．肉桂酰胺的最適轉(zhuǎn)化生產(chǎn)條件：轉(zhuǎn)化溫度30℃、初始轉(zhuǎn)化pH 7.5、赤紅球菌菌體質(zhì)量濃度為2.6g/L、底物肉桂腈濃度為1.5mol/L，轉(zhuǎn)化5h后轉(zhuǎn)化率達(dá)100%且無副產(chǎn)物生成．

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責(zé)任編輯：常濤

Biotransformation of Cinnamonitrile into Cinnamamide with Rhodococcus ruber CGMCC3090

ZHAI Ying，SHEN Yanbing，TANG Rui，ZHENG Yu，WANG Min

(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

At present，the method of cinnamamide production consists of two steps by using cinnamic acid，thionyl chloride and strong ammonia water. This chemical process has less security，product separation and purification are difficult and there are some other problems. To solve these problems，the process of biotransformation of cinnamonitrile into cinnamamide using Rhodococcus ruber CGMCC3090,was established. It was found that the conversion after 5h can reach 100% when the cinnamonitrile was 1.5mol/L，the cell concentration was 2.6g/L，the temperature 30℃ and pH 7.5. This process has the advantage of high product purity without formation of cinnamic acid. It has laid a good foundation for the scale-up process and practical production of cinnamamide biosynthesis with R. ruber CGMCC3090.

Rhodococcus；biotransformation；cinnamamide；nitrile hydratase

TQ920.1

A

1672-6510(2014)04-0011-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.04.003

2014–01–09；

2014–02–27

國家自然科學(xué)基金資助項目(21276196)

翟 瑩（1986—），女，山東菏澤人，碩士研究生；通信作者：王 敏，教授，minw@tust.edu.cn.