不同亞型人SMYD3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性比較

劉 磊，羅學(xué)剛，趙文文，穆 愛，辛中帥，張同存

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2. 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

不同亞型人SMYD3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性比較

劉 磊1，羅學(xué)剛1，趙文文1，穆 愛1，辛中帥2，張同存1

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2. 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

利用PCR方法克隆SMYD3兩個(gè)亞型的啟動(dòng)子區(qū)域，并構(gòu)建其熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒．轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，利用熒光素酶報(bào)告分析技術(shù)，對(duì)二者啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了檢測(cè)和比較．結(jié)果顯示：SMYD3亞型1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性要顯著高于亞型2啟動(dòng)子，生物信息學(xué)分析提示其原因可能與含有轉(zhuǎn)錄因子E2F-1結(jié)合位點(diǎn)的串聯(lián)重復(fù)序列有關(guān)．

SMYD3；啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)錄活性

SMYD3(SET and MYND domain containing 3)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有組蛋白甲基化活性的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶．研究[1–2]發(fā)現(xiàn)，SMYD3在肝癌、乳腺癌及直腸癌中呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)，提示其可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用．SMYD3可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖、粘附及遷移能力，并促使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，采用shRNA特異性干擾SMYD3基因后則可以明顯抑制乳腺癌、宮頸癌等癌細(xì)胞的增殖與遷移能力，并誘導(dǎo)其凋亡[3–7]．

SMYD3具有兩個(gè)亞型，分別由兩個(gè)不同的啟動(dòng)子調(diào)控二者的轉(zhuǎn)錄過程．然而，對(duì)于SMYD3兩種不同亞型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及其不同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性間的差異，迄今尚未見報(bào)道．本文通過構(gòu)建SMYD3兩個(gè)亞型啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，通過報(bào)告分析方法檢測(cè)二者啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性差異，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，探討二者啟動(dòng)子差異在SMYD3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的影響，為進(jìn)一步研究SMYD3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制以及新型抗腫瘤藥物研發(fā)提供理論指導(dǎo)．

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

pGL3-basic熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒、T4,DNA連接酶，美國(guó)Promega公司；Taq DNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司；dNTP(濃度10mmol/L)、DM2000,plus DNA,Marker、DNA回收試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；氨芐青霉素、青鏈雙抗、胰酶、RNA酶、Tris飽和酚、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，天津康源生物科技有限公司；D-MEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；胰蛋白胨、酵母抽提物，英國(guó)OXOID公司；三氯甲烷，天津市江天化工技術(shù)有限公司；SDS，美國(guó)Sigma公司；PCR引物，美國(guó)Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠，美國(guó)基因公司；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Turbofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，美國(guó)Thermo公司；限制性內(nèi)切酶，美國(guó)Fermentas公司；多功能微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)基因公司；PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司．

1.2 菌株與細(xì)胞株

E.,coli DH5α菌株，本實(shí)驗(yàn)室保藏；人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞系COS-7，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection，ATCC)．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7及COS-7細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈雙抗的D-MEM/F-12培養(yǎng)基于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．

1.3.2 MCF-7細(xì)胞基因組的提取

用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化鋪滿10cm培養(yǎng)皿皿底的MCF-7細(xì)胞，并用冰冷的PBS緩沖液將細(xì)胞吹下，1,000r/min離心10min，收集細(xì)胞．用PBS緩沖液重懸并漂洗細(xì)胞沉淀．用5mL DNA抽提緩沖液重懸細(xì)胞，加入25μL蛋白酶K使其終質(zhì)量濃度達(dá)到100,μg/mL并混勻，56℃水浴3h．加入與之等體積的Tris飽和酚抽提一次，12,000r/min離心10min收集水相，再用與水相等體積的氯仿抽提一次，12,000r/min離心10min收集水相于一個(gè)潔凈的EP管中，加入與水相等體積的異丙醇和適量的3mol/L NaCl溶液，使得NaCl終濃度為0.2mol/L，于－20℃靜置90min．室溫下12,000r/min離心5min，棄上清液．將基因組沉淀用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液漂洗兩次，烘干后溶于適量TE緩沖液中．

1.3.3 人SMYD3兩個(gè)亞型啟動(dòng)子區(qū)域熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建

利用Mat Inspector對(duì)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心(NCBI)已經(jīng)公布的人類SMYD3基因序列及UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)公布的SMYD3基因CDS區(qū)5′-上游序列進(jìn)行序列分析，選擇無轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)區(qū)段設(shè)計(jì)兩端分別帶有MluⅠ和XhoⅠ的引物，SMYD3亞型1上游引物為5′-AGGACGCGTTGAGCCAATATCGTAC CAC-3′，下游引物為5′-CGACTCGAGGGTTGCGAA CTTTTCCAC-3′；SMYD3亞型2上游引物為5′-CGAA CGCGTGTTGCTTTTTGGTCTTAG-3′，下游引物為5′-CTACTCGAGCCCATCTCCCTGACTGCTAG-3′．將合成的引物稀釋至工作濃度，以人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7基因組為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)在94℃變性45,s，58℃退火45,s和72℃延伸1.5min，循環(huán)30次的反應(yīng)條件下分別擴(kuò)增兩個(gè)SMYD3亞型啟動(dòng)子片段，得到SMYD3亞型1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游839,bp至下游128,bp的啟動(dòng)子片段及SMYD3亞型2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游808,bp至下游201,bp的啟動(dòng)子片段．分別利用MluⅠ和XhoⅠ特異性切割PCR產(chǎn)物兩端及pGL3-basic載體多克隆位點(diǎn)，切割產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠切膠回收后連接．連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.,coli DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證及雙酶切驗(yàn)證將陽(yáng)性克隆分別以GLP2(-)和RVP(+)為引物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫(kù)公布序列進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證是否將正確的目的啟動(dòng)子片段連接至pGL3-basic載體上．

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶報(bào)告分析

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化并用適量D-MEM/F-12培養(yǎng)基吹懸至單細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105mL-1，每孔接種1mL細(xì)胞懸液．于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16h．利用Turbofect Transfection Regent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，1,μg質(zhì)粒使用2μL脂質(zhì)體，37℃孵育20min，加入孔板中．加好的孔板置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的恒溫培養(yǎng)箱孵育6h，更換D-MEM/F-12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入Luciferase Assay裂解液，利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及多功能微孔板檢測(cè)儀測(cè)定總蛋白質(zhì)量濃度及熒光強(qiáng)度．根據(jù)式(1)核算各實(shí)驗(yàn)組啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性與對(duì)照組的倍數(shù)值，其水平高低與啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系．

式中：F為相對(duì)熒光活性(RLU)倍數(shù)；Is為樣品熒光強(qiáng)度平均值；ρs為樣品蛋白質(zhì)量濃度平均值；Ic為Control組熒光強(qiáng)度平均值；ρc為Control組蛋白質(zhì)量濃度平均值．

2 結(jié)果與分析

2.1 人SMYD3兩個(gè)亞型啟動(dòng)子區(qū)域熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建

為了獲得分析得到的SMYD3不同亞型啟動(dòng)子片段，實(shí)驗(yàn)中通過PCR反應(yīng)，從MCF-7細(xì)胞基因組中擴(kuò)增目的片段，其中亞型1啟動(dòng)子由于GC含量較高(54.8%)，經(jīng)優(yōu)化后采用GC buffer可實(shí)現(xiàn)有效的擴(kuò)增，結(jié)果如圖1、圖2所示．

圖1 人SMYD3轉(zhuǎn)錄亞型1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 1 Construction of the luciferase reporter plasmid of human SMYD3 isoform promoter 1

圖2 人SMYD3轉(zhuǎn)錄亞型2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 2 Construction of the luciferase reporter plasmid of human SMYD3 isoform promoter 2

圖(a)中除M泳道外，其余泳道位于1,000,bp附近的明亮條帶均為目的PCR產(chǎn)物．圖(b)中除M泳道外，其余泳道5,000,bp附近明亮條帶均為線性pGL3-basic質(zhì)粒條帶，1,000,bp附近的DNA條帶均為目的片段條帶．所有陽(yáng)性克隆均經(jīng)測(cè)序及序列比對(duì)，證明與已公布序列完全匹配，表明SMYD3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建成功．

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

為了確保細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，本文用可表達(dá)綠色熒光蛋白的pEGFP-C3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并在藍(lán)色激發(fā)光下觀察正常表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比對(duì)，結(jié)果如圖3所示．

圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)Fig. 3 Detection of the transfection efficiency

2.3 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析

分別將構(gòu)建成功的SMYD3亞型1、亞型2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COS-7和MCF-7細(xì)胞中，24h后裂解細(xì)胞測(cè)定熒光素酶活性，結(jié)果如圖4所示．結(jié)果表明：SMYD3亞型1與亞型2的啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性均顯著高于各自在正常細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性，而且不論是正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞，SMYD3亞型1的轉(zhuǎn)錄活性均明顯強(qiáng)于亞型2的啟動(dòng)子．表明SMYD3亞型1是細(xì)胞中的優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄形式，其異常表達(dá)很可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)．

圖4 人SMYD3兩個(gè)亞型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性比較Fig. 4 Comparison of the transcriptional activities of human SMYD3 promoters

2.4 人SMYD3啟動(dòng)子區(qū)域序列分析

根據(jù)對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析可發(fā)現(xiàn)：從MCF-7乳腺癌細(xì)胞中克隆獲得的人SMYD3亞型1啟動(dòng)子中含有2個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄因子E2F-1結(jié)合位點(diǎn)(5′-CCGCC-3′)，如圖5(a)所示．進(jìn)一步對(duì)不同物種SMYD3啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在人、野駱駝、長(zhǎng)尾龍貓、獼猴等不同物種中普遍存在，且序列高度保守，如圖5(b)所示．表明該元件在物種進(jìn)化的過程中具有較高的保守性．而對(duì)人SMYD3亞型2啟動(dòng)子的分析，則沒有發(fā)現(xiàn)該結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合前人關(guān)于E2F-1結(jié)合位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性與腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的報(bào)道[8]，認(rèn)為該結(jié)合位點(diǎn)的存在可能是造成SMYD3亞型1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)于亞型2的重要原因之一．

圖5 SMYD3啟動(dòng)子區(qū)域分析及比對(duì)Fig. 5 Analysis and comparison of SMYD3 promotor regions

3 討 論

謝景航等[9]也曾對(duì)SMYD3亞型2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游－1,527～+123,bp序列進(jìn)行過分析，但他們的結(jié)果顯示，各截短片段轉(zhuǎn)錄活性與空載質(zhì)粒并無顯著差異．表明該亞型SMYD3可能不是其最主要的轉(zhuǎn)錄形式．本研究也發(fā)現(xiàn)SMYD3亞型2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性要顯著低于亞型1啟動(dòng)子．通過對(duì)SMYD3兩個(gè)轉(zhuǎn)錄亞型啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)亞型1啟動(dòng)子中含有2個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄因子E2F-1結(jié)合位點(diǎn)(5′-CCGCC-3′)，而在亞型2啟動(dòng)子中則沒有，推測(cè)這可能是亞型1轉(zhuǎn)錄活性顯著增高的重要原因之一．研究已顯示：SMYD3 5′-調(diào)控區(qū)域的E2F-1結(jié)合位點(diǎn)可變數(shù)目串連重復(fù)多態(tài)性(variable number of tandem repeats polymorphism，VNTR)與腫瘤的發(fā)生過程有著密切的關(guān)系，很可能是造成癌變幾率個(gè)體差異的重要原因之一．日本東京大學(xué)Tsuge等[8]發(fā)現(xiàn)：在SMYD3基因5′-調(diào)控區(qū)域存在E2F結(jié)合位點(diǎn)的串連重復(fù)序列，其拷貝數(shù)與結(jié)腸癌、肝癌以及乳腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)性間有著緊密的聯(lián)系．E2F-1屬于E2F核轉(zhuǎn)錄因子家族成員，而E2F核轉(zhuǎn)錄因子家族與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑癌基因RB構(gòu)成的RB/E2F信號(hào)通路在細(xì)胞周期的調(diào)控及癌癥發(fā)生過程中有著重要的作用[10]．因此，Tsuge等認(rèn)為，SMYD3很可能是RB-E2F信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)下游靶點(diǎn)，5′-CCGCC-3′序列拷貝數(shù)增多將可能增強(qiáng)SMYD3與E2F-1的親和力，從而導(dǎo)致結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌和乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)性增加．此外，德國(guó)癌癥研究中心的Frank等[11]、以及香港大學(xué)Wang等[12]的研究則與Tsuge等的有所不同，其原因很可能與患者人群的差異有關(guān)．

此外，Hamamoto等[1]通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)：SMYD3可上調(diào)細(xì)胞周期依賴激酶CDK2的表達(dá)．CDK2對(duì)于細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換以及S期的進(jìn)程具有十分重要的作用，在G1期末，CDK2將與細(xì)胞周期蛋白E結(jié)合，磷酸化RB蛋白，使其釋放E2F家族轉(zhuǎn)錄因子，從而促使DNA合成得以進(jìn)行，這一過程對(duì)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換起著至關(guān)重要的作用．在進(jìn)入S期后，CDK2又將與細(xì)胞周期蛋白A結(jié)合，調(diào)控S期的進(jìn)程[13–14]．結(jié)合本文的研究，認(rèn)為SMYD3亞型1可能是細(xì)胞中的主要表達(dá)形式，其啟動(dòng)子區(qū)域E2F-1結(jié)合位點(diǎn)的串聯(lián)重復(fù)拷貝會(huì)增強(qiáng)E2F-1與其結(jié)合，從而增強(qiáng)SMYD3亞型1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)．而SMYD3高表達(dá)后又會(huì)造成CDK2表達(dá)上調(diào)，CDK2進(jìn)而促發(fā)RB的高度磷酸化，使E2F-1得以釋放，E2F-1又可以再次與SMYD3 5′-調(diào)控區(qū)域結(jié)合引發(fā)后者的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)．如此的正反饋循環(huán)將造成細(xì)胞周期過度活躍，細(xì)胞始終處于旺盛的增殖狀態(tài)中，從而促發(fā)及推動(dòng)了癌癥的發(fā)展．我們將在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)這一推論．

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責(zé)任編輯：周建軍

Comparison of Transcriptional Activities of Different Human SMYD3 Isoforms

LIU Lei1，LUO Xuegang1，ZHAO Wenwen1，MU Ai1，XIN Zhongshuai2，ZHANG Tongcun1

(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. National Institute for Food and Drug Control，Beijing 100050，China)

In this study，promoters of two isoforms were cloned with PCR method and then their luciferase reporter plasmids were constructed. Using the method of Luciferase Assay，the transcriptional activities of these two promotors of SMYD3 were detected in COS-7 cells. Results showed that the transcriptional activity of the promoter of isoform 1 is higher that that of the promoter of isoform 2. Bioinformatics analyses indicated that the significant difference in the transcriptional activity between these two promoters might be due to the tandem repeats of E2F-1 binding sites located in the promoter of isoform 1.

SMYD3；promotor；transcriptional activity

Q786

A

1672-6510(2014)04-0006-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.04.002

2013–12–05；

2014–03–11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31000343，31300642，31071126)

劉 磊（1988—），男，天津人，碩士研究生；通信作者：羅學(xué)剛，副教授，luoxuegang@tust.edu.cn.