知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜制備及體外抗腫瘤活性的初步研究

霍中華，尹 鵬，侯樂(lè)偉，呂 盛，胡 君，儲(chǔ)著凌，欒榮剛，胡國(guó)強(qiáng)（解放軍454醫(yī)院普外科，江蘇 南京 210002）

·實(shí)驗(yàn)研究·

知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜制備及體外抗腫瘤活性的初步研究

霍中華，尹 鵬，侯樂(lè)偉，呂 盛，胡 君，儲(chǔ)著凌，欒榮剛，胡國(guó)強(qiáng)（解放軍454醫(yī)院普外科，江蘇 南京 210002）

目的：探索知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜的制備方法，為后續(xù)進(jìn)行體內(nèi)相關(guān)研究打好基礎(chǔ)。方法：將知母皂苷B-Ⅱ與聚乳酸（PLLA）按照不同比例制成知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜；分別采用掃描電鏡、紅外光譜分析、LC-MS/MS檢測(cè)方法對(duì)纖維膜理化性質(zhì)表征、生物相容性、緩釋性能等進(jìn)行測(cè)試；采用CCK-8法檢測(cè)載藥納米膜緩釋藥物抑制胃癌細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果：12%的知母皂苷B-Ⅱ濃度為最佳載藥濃度；在制備載知母皂苷B-Ⅱ納米纖維的過(guò)程中，靜電紡絲技術(shù)能保持兩種組分各自的化學(xué)特征及物理性質(zhì)；知母皂苷B-Ⅱ?qū)w維膜的熱穩(wěn)定性影響不大，兩者相容性較好；知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜可有效釋放知母皂苷B-Ⅱ，明顯抑制BGC-823細(xì)胞的增殖活性，在48 h、72 h與對(duì)照組細(xì)胞相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。結(jié)論：知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜通過(guò)緩釋藥物可有效抑制BGC-823細(xì)胞的增殖能力。

納米纖維膜；藥物緩釋?zhuān)豢鼓[瘤；知母皂苷B-Ⅱ

胃癌作為危害人類(lèi)健康常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率仍高居消化道腫瘤的首位。手術(shù)切除是胃癌治療最常用的方法，但術(shù)后常存在殘留的腫瘤細(xì)胞，易造成腫瘤復(fù)發(fā)，嚴(yán)重制約患者生存期的延長(zhǎng)。因此，探索一種副作用小、選擇性高、療效好的方法來(lái)消滅殘留的腫瘤細(xì)胞，抑制術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)，已成為當(dāng)前國(guó)際醫(yī)藥學(xué)界面臨的一項(xiàng)重要而又迫切的前沿課題[1-3]。

將靜電紡制備載藥納米纖維技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合是近年興起的一個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外有多個(gè)課題組在該領(lǐng)域進(jìn)行了初步研究[4-6]。知母皂苷B-Ⅱ具有體外抗炎活性，其在mRNA和蛋白表達(dá)水平可抑制LPS誘導(dǎo)的白介素-1β、腫瘤壞死因子-1 α和白介素-6等炎癥因子的表達(dá)，同時(shí)抑制細(xì)胞核因子NF-κB和促細(xì)胞分裂劑激活性蛋白激酶活性，而知母皂苷B-Ⅱ的抗腫瘤活性在近年來(lái)越來(lái)越受到重視[7-9]。

目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)知母皂苷載藥納米纖維膜抗胃癌肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究報(bào)道。本研究將中藥知母皂苷B-Ⅱ與生物可降解高分子材料聚乳酸（PLLA）根據(jù)各自的理化性質(zhì)，配成靜電紡溶液，再用靜電紡絲技術(shù)將上述混合液制成納米纖維膜；對(duì)該纖維膜進(jìn)行理化性質(zhì)表征、生物相容性測(cè)試、緩釋性能測(cè)試和體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，為后續(xù)研究打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），移液器、離心機(jī)（Eppendorf公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），高壓靜電發(fā)生器（天津東文高壓電源有限公司），掃描電子顯微鏡（日立公司），紅外-拉曼光譜儀（美國(guó)尼高力儀器公司），CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所）；人胃癌細(xì)胞株BGC-823（中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫(kù)），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（Invitrogen公司），聚乳酸（PLLA，濟(jì)南岱罡生物科技有限公司），知母皂苷B-Ⅱ（藥用原料，第二軍醫(yī)大學(xué)制備，批號(hào)20090528）。

1.2 方法

1.2.1 載藥納米纖維膜的制備采用三氯甲烷和丙酮作為復(fù)合溶劑，溶解知母皂苷B-Ⅱ和PLLA，將一定質(zhì)量的PLLA及一定比例的藥物溶解在三氯甲烷中，將溶液密封后，放置于磁力攪拌器上，充分溶解3 ～ 4 h至溶液透明澄清。為研究不同藥物濃度與PLLA對(duì)電紡纖維的形態(tài)影響，將藥物與PLLA之比分別控制在5%、10%、12%、15%。將配制好的高聚物溶液吸入到5 mL醫(yī)用注射器中，注射器采用鋼制針頭并將其通過(guò)鱷魚(yú)夾與高壓電源相連。針頭尖端磨平，外徑為l mm，內(nèi)徑為0.7 mm，針頭長(zhǎng)度為30 mm，采用8號(hào)針頭，將其尖頭磨平。注射器固定在恒流注射泵上，首先以注射泵控制溶液流速約為1.0 mL·h-1，纖維收集到置于針頭前方的接地鋁箔上（28 cm × 21 cm），并調(diào)整接收鋁箔與針頭間距為15 cm，電壓設(shè)置為18 kV，電紡纖維以無(wú)紡膜的形式收集在接收鋁箔上。

1.2.2 載藥納米纖維膜的表征通過(guò)掃描電鏡SEM對(duì)載藥納米纖維膜的表面結(jié)構(gòu)及形貌進(jìn)行觀察。觀察知母皂苷B-Ⅱ藥物濃度的增加與載藥納米纖維的直徑變化關(guān)系，確定知母皂苷B-Ⅱ的最佳使用濃度。觀察載藥電紡纖維間的交聯(lián)，分析評(píng)價(jià)藥物分子對(duì)纖維成絲的影響。

1.2.3 DSC分析將靜電紡絲試樣首先剪碎，然后用DSC204F1型差示掃描量熱分析儀對(duì)其進(jìn)行差熱分析，采用升溫速率為10 ℃·min-1，升溫范圍為40 ～220 ℃，N2作為保護(hù)氣體，其流速為20 mL·min-1。

1.2.4 纖維膜的紅外光譜分析將藥物與KBr在研缽中制成細(xì)小粉末，然后壓片，接著放入紅外-拉曼光譜儀中進(jìn)行測(cè)試分析。在測(cè)定電紡纖維膜時(shí)，可直接將纖維膜固定在鐵架上，然后置于紅外-拉曼光譜儀中。

1.2.5 載藥納米膜藥物釋放曲線將載藥納米纖維膜剪成1 cm×1 cm正方形，使用環(huán)氧乙烷進(jìn)行無(wú)菌處理。將纖維膜放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔添加2 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，37 ℃放置，每隔2 h，取一復(fù)孔中的培養(yǎng)基，1000 r·min-1離心處理后– 20 ℃保存待測(cè)。待所有樣本收集后，LC-MS/MS檢測(cè)溶液中知母皂苷B-Ⅱ含量。色譜柱:Waters公司XTerraTM MS C18柱；流動(dòng)相:甲醇-乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨（37.5∶37.5∶25）；流速:0.2 mL·min-1。萃取流動(dòng)相:乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨溶液；離子源:ESI源；檢測(cè)方式:負(fù)離子檢測(cè)；掃描方式:選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z 919.4→m/z 757.4；掃描時(shí)間為100 ms；離子噴射電壓4.5 kV；毛細(xì)管電壓為44 V；溫度270 ℃；鞘氣流速10 arb；輔助氣流速12 arb；掃氣流速5 arb；其他優(yōu)化參數(shù)為以直接進(jìn)樣方式注入知母皂苷B-Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品（0.1 μg·mL-1，10 μL·min-1）后儀器自動(dòng)調(diào)諧（Tune）獲得。在一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中獲得知母皂苷B-Ⅱ準(zhǔn)分子離子峰m/z 919，對(duì)［M-H］－進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，準(zhǔn)分子離子裂解生成的主要碎片離子m/z 757，用于定量分析。將測(cè)得溶液中的知母皂苷B-Ⅱ濃度與時(shí)間繪制藥物緩釋曲線。

1.2.6 纖維膜緩釋藥物抑制胃癌細(xì)胞增殖檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞，胰酶消化法制備細(xì)胞懸液，血小球計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)·mL-1，接種細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL細(xì)胞懸液。同時(shí)，取5 mm × 5 mm面積的知母皂苷B-Ⅱ纖維膜放入孔中，37 ℃及5% CO2條件下培養(yǎng)24、48、72 h。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性，檢測(cè)前去掉纖維膜，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用析因分析進(jìn)行組間差異及組內(nèi)差異的比較。P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載藥納米纖維的SEM觀察

在5%P L L A的濃度下，配置含知母皂苷B-Ⅱ10%、12%和15%[濃度定義為溶質(zhì)的質(zhì)量（g）與溶液總質(zhì)量（g）的比值]的載藥溶液，然后進(jìn)行電紡。采取靜電紡絲電壓為18 kV，紡絲距離為12 cm，給液速率為1.0 mL·h-1，針頭的孔徑取1 mm，研究紡絲的結(jié)果詳見(jiàn)圖1及表1。

圖1 5%PLLA載藥納米纖維的SEM圖A – 10%知母皂苷B-Ⅱ，B – 12%知母皂苷B-Ⅱ，C – 15%知母皂苷B-Ⅱ，D – PLLA空白對(duì)照組Fig 1 SEM images of 5% PLLA drug loaded nano fi bersA – 10% timosaponin B-Ⅱ, B – 12% timosaponin B-Ⅱ, C – 15% timosaponin B-Ⅱ, D – PLLA control group

表1 不同載藥濃度的纖維平均直徑Tab 1 Average diameters of drug loaded fi bers of timosaponin B-Ⅱwith different concentrations

由表1的數(shù)據(jù)可知隨著知母皂苷B-Ⅱ藥物濃度的增加，載藥納米纖維的直徑減小，但波動(dòng)不大。但是由掃描電鏡SEM的圖可知，濃度為5%的PLLA體系中，當(dāng)知母皂苷B-Ⅱ的濃度超過(guò)12%時(shí)，靜電紡絲效果不佳（圖1），隨著溶液濃度的增加待紡溶液黏度極大，且溶劑揮發(fā)很快，已很難及時(shí)拉伸成絲，所以形成了如圖所示的許多小的高聚物顆粒。而當(dāng)知母皂苷B-Ⅱ的濃度小于12%時(shí)電紡效果較好，偶爾有折變纖維，并且電紡成絲量較高?？紤]到產(chǎn)量、載藥量及纖維質(zhì)量，最終選取12%為最佳載藥濃度，進(jìn)行后續(xù)的測(cè)試。同時(shí)，與沒(méi)加藥的PLLA靜電紡絲纖維相比，載藥的電紡纖維間有一些交聯(lián)，表明當(dāng)加入外來(lái)的藥物分子時(shí)，對(duì)纖維的成絲還是有少許影響。

2.2 纖維膜的紅外光譜分析

通過(guò)紅外光譜可以檢測(cè)PLLA與光動(dòng)力藥物共混后靜電紡纖維的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還可檢測(cè)它們之間是否存在分子間的相互作用。確定兩個(gè)高分子材料之間是否存在相互作用，可以通過(guò)兩者材料分子之間是否有新的反應(yīng)基團(tuán)生成來(lái)確定它們之間是否存在化學(xué)反應(yīng)。若分子間生成氫鍵的相互作用可以通過(guò)觀察主要基團(tuán)特征吸收峰是否發(fā)生頻率的變化來(lái)確定，因?yàn)榉肿娱g特定的交互作用會(huì)影響局部的電荷密度而引起基團(tuán)特征峰頻率的變化。通過(guò)傅里葉紅外光譜儀對(duì)純PLLA電紡膜、光動(dòng)力藥物和載有藥物的PLLA電紡膜的化學(xué)組成進(jìn)行了表征。紡絲原料采用KBr壓片制樣，納米纖維膜直接掃描。其中，載有知母皂苷B-Ⅱ藥物的PLLA納米纖維膜的紅外光譜圖，詳見(jiàn)圖2。

圖2 紅外光譜圖A – 純PLLA電紡膜，B – 知母皂苷B-Ⅱ電紡膜Fig 2 Infrared spectroscopysA – pure PLLA electrospun membranes, B – timosaponin B-Ⅱloaded PLLA electrospun membranes

結(jié)果顯示，在波頻1745 ～ 1755 cm-1處為PLLA與知母皂苷特征吸收峰，即C=O的伸縮振動(dòng)峰，當(dāng)進(jìn)行混紡載藥時(shí)，該吸收峰仍然很顯著。圖2-A中1074 ～1039 cm-1區(qū)域，為PLLA的-COO-的特征吸收峰。在2900 ～ 3000 cm-1處為甲基的伸縮振動(dòng)吸收峰。圖2-B中的知母皂苷出峰區(qū)域與純PLLA電紡膜一致。說(shuō)明在溶液的配制和靜電紡絲過(guò)程中，PLLA與知母皂苷B-Ⅱ沒(méi)有發(fā)生任何反應(yīng)，只是簡(jiǎn)單的共混而已。說(shuō)明用靜電紡絲技術(shù)在制備載知母皂苷B-Ⅱ納米纖維的過(guò)程中能保持兩種組分各自的化學(xué)特征及物理性質(zhì)。

2.3 納米纖維膜的熱性能分析

通過(guò)對(duì)載藥納米纖維的DSC熱性能分析，可以得到納米纖維的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）和熔點(diǎn)，從而可以分析得到納米纖維中的藥物是否穩(wěn)定以及其性質(zhì)是否發(fā)生改變。通過(guò)對(duì)純PLLA納米纖維膜以及載藥納米纖維膜的DSC測(cè)試，其具體測(cè)試數(shù)據(jù)和圖譜如圖3和表2所示。

圖3 純PLLA電紡膜以及載藥PLLA電紡膜的DSC圖譜A – 純PLLA電紡膜，B – 載藥（15%知母皂苷B-Ⅱ）電紡膜，C – 載藥（12%知母皂苷B-Ⅱ）電紡膜Fig 3 DSC curves of pure and drug loaded PLLA electrospun membranesA – pure PLLA electrospun membranes, B – drug loaded (15% timosaponin B-Ⅱ) PLLA electrospun membranes, C – drug loaded (12% timosaponin B-Ⅱ) PLLA electrospun membranes

表2 純PLLA電紡膜以及載藥PLLA電紡膜的熱學(xué)性能Tab 2 Thermal properties of pure and drug loaded PLLA electrospun membranes

由上圖3和表2顯示，知母皂苷B-Ⅱ在80 ℃左右有一個(gè)很小的吸熱峰，此時(shí)峰所對(duì)應(yīng)的溫度為T(mén)g。而在180 ℃左右有個(gè)較大的峰，所對(duì)應(yīng)的溫度稱(chēng)為PLLA的熔點(diǎn)。兩種濃度的知母皂苷B-Ⅱ電紡膜的Tg均發(fā)生細(xì)微的偏移，而12%的知母皂苷B-Ⅱ偏移度稍小，說(shuō)明載藥后分子間與水的相互鍵合作用發(fā)生了細(xì)微的變化，知母皂苷B-Ⅱ?qū)w維膜的熱穩(wěn)定性影響不大，同時(shí)也進(jìn)一步說(shuō)明靜電紡后知母皂苷B-Ⅱ與PLLA之間沒(méi)有發(fā)生相互作用，兩者相容性較好。

2.4 載知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜緩釋曲線

37 ℃放置，載知母皂苷B-Ⅱ纖維膜緩慢釋放知母皂苷B-Ⅱ至培養(yǎng)液中，釋放速率在2 ～ 4 h之間最高，之后趨緩并維持在1 mg·mL-1上下。 詳見(jiàn)圖4。

圖4 載知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜緩釋曲線Fig 4 Releasing curve of timosaponin B-Ⅱloaded nano fi ber membranes

2.5 腫瘤細(xì)胞活性檢測(cè)

載知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜與BGC-823細(xì)胞共孵育不同時(shí)間，CCK-8檢測(cè)其細(xì)胞活性。圖5顯示，在對(duì)數(shù)增殖期，載藥納米纖維膜能夠明顯抑制BGC-823細(xì)胞增殖活性，統(tǒng)計(jì)分析顯示48、72 h與對(duì)照組細(xì)胞相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。納米膜對(duì)照組與細(xì)胞對(duì)照組比較，細(xì)胞活性無(wú)明顯變化（P ＞0.05），表明納米膜本身無(wú)明顯細(xì)胞毒性。

圖5 細(xì)胞活性檢測(cè)注:相同時(shí)間點(diǎn)時(shí)，與細(xì)胞對(duì)照組比較，**P ＜ 0.01Fig 5 Detection of cell viabilityNote: compared with control group at the same time,**P ＜ 0.01

3 討論

近年來(lái)植物來(lái)源的抗腫瘤藥物重新引起人們的重視，因其不只對(duì)發(fā)現(xiàn)新藥有巨大潛力，還可為設(shè)計(jì)理想新藥提供獨(dú)特結(jié)構(gòu)的化合物[10-12]。皂苷是一類(lèi)較復(fù)雜的化合物，在植物界分布很廣，如人參、三七、威靈仙、知母、遠(yuǎn)志、桔梗、柴胡等。皂苷除了具有溶血、殺精、細(xì)胞毒作用外，有些還具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降膽固醇、保肝、降血糖、抗微生物和心血管活性等作用。

知母皂苷B-Ⅱ是傳統(tǒng)中藥知母提純的化學(xué)單體之一，多年來(lái)對(duì)其大量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)，其具有免疫抑制、抗炎、抗抑郁等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于臨床[13-14]。新近的研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，該藥還具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)其凋亡等生物活性。

靜電紡絲技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、有效的制備納米纖維的方法?？缮锝到夂蜕锵嗳菪缘募{米纖維具有極大的比表面積、高孔隙率和三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，能夠從生物功能和結(jié)構(gòu)方面很好地為細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)提供良好的體外環(huán)境。靜電納米纖維同時(shí)也是一種良好的藥物載體，其具有多孔結(jié)構(gòu)和較高的比表面積，可以應(yīng)用在很多領(lǐng)域，如光學(xué)和化學(xué)傳感器、納米增強(qiáng)材料、組織工程支架、創(chuàng)傷敷料、藥物傳輸和控制釋放、過(guò)濾及防護(hù)衣等?？缮锝到飧叻肿硬牧希ㄈ鏟LA、PLGA、PCL及其共聚物）由于其良好的生物降解性而被加工成電紡絲超細(xì)纖維，可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域[17-19]。

對(duì)于靜電紡知母皂苷B-Ⅱ/PLLA載藥體系的研究，我們首先制備了靜電紡PLLA纖維、知母皂苷B-Ⅱ/PLLA復(fù)合納米纖維，分析研究藥物的加入對(duì)PLLA纖維的形貌、直徑、熱學(xué)性能、內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，知母皂苷B-Ⅱ可以成功的負(fù)載到PLLA纖維內(nèi)部，其加入對(duì)纖維的形貌、直徑、熱學(xué)性能等沒(méi)有明顯影響，而纖維直徑隨藥物含量的增加而增加。我們通過(guò)對(duì)載知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜的表征分析，結(jié)果顯示本課題所使用的材料具有很好的絲狀結(jié)構(gòu)。藥物緩釋曲線和腫瘤抑制率檢測(cè)結(jié)果表明，載知母皂苷B-Ⅱ納米纖維膜在一般培養(yǎng)液中能長(zhǎng)期、穩(wěn)定釋放藥物的有效成分，從而對(duì)胃癌細(xì)胞株產(chǎn)生持續(xù)的增殖活性抑制能力。

上述結(jié)果對(duì)于尋找一種副作用小、選擇性高、療效好的微創(chuàng)方法，旨在消滅術(shù)后殘留腫瘤細(xì)胞以及防止術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，具有積極的作用；同時(shí)，也為后續(xù)進(jìn)行體內(nèi)一系列的相關(guān)研究提供參考。

[1]朱陵君，李曉林，李茹恬，等.智能型靶向納米給藥系統(tǒng)-提高腫瘤治療效果的新途徑[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2009，14（4）: 373-376.

[2]張東.肺癌的靶向治療[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2006，3（4）: 41-44.

[3]Hughes GA. Nanostructure-mediated drug delivery[J]. Nanomedicine, 2005, 1(1): 22-30.

[4]李楠，王雪明，齊宏旭，等.電紡絲聚乳酸、聚3羥基丁酸酯共聚4羥基丁酸酯和聚碳酸亞丙酯納米纖維的制備及表面親水性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（12）:2273-2276.

[5]魏安方，汪學(xué)騫，王娟，等.基于不同溶液體系載藥納米纖維膜的制備[J].紡織學(xué)報(bào)，2009，30（10）:19-22.

[6]章杰兵，于雷，劉梅，等.血余炭納米纖維膜抗菌活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2012，9（5）:264-267.

[7]King FW, Fong S, Griffin C, et al. Timosaponin AⅢ is preferentially cytotoxic to tumor cells through inhibition of mTOR and induction of ER stress[J]. J PLos One, 2009, 4(9): 326.

[8]Kang YJ, Chung HJ, Nam JW, et al. Cytotoxic and antineoplastic activity of timosaponin A-Ⅲ for human colon cancer cells[J]. J Nat Prod, 2011, 74(4): 701-706.

[9]劉卓，金英，隋海娟，等.知母皂苷對(duì)Aβ25-35引起的巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放的抑制作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（5）:695-700.

[10]陸雪瑩，李艷紅，肖向文，等.木犀草素抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖作用的研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21（3）: 246-249.

[11]劉文，鞏平.左旋棉酚抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（1）:196-198.

[12]李淑女.異黃酮類(lèi)物質(zhì)抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8（33）:11-12.

[13]Lu WQ, Qiu Y, Li TJ, et al. Timosaponin B-Ⅱ inhibits proinflammatory cytokine induction by lipopolysaccharide in BV2 cells[J]. Arch Pharm Res, 2009, 32(9): 1301-1308.

[14]蔡飛，王維泓，高守紅，等.知母皂苷及其苷元的藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2011，29（5）:331-335.

[15]劉卓，金英，隋海娟，等.知母皂苷抑制Aβ25-35引起巨噬細(xì)胞TNF-α釋放及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制[J].中國(guó)藥理與臨床，2011，27（6）:19-21.

[16]王艷，王艷杰，宋少江，等.知母總皂苷對(duì)β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32（13）:2778-2781.

[17]梁爽，李權(quán)，唐休發(fā)，等.靜電紡絲納米纖維膜作為骨骼肌組織工程支架材料的細(xì)胞相容性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（12）:2171-2174.

[18]王立新，張幼珠，何莉.靜電紡再生絲素納米纖維載藥體系研究[J].絲綢，2007（6）:17-19.

[19]顏娜，蔡晴，楊小平，等.電紡載鹽酸四環(huán)素的聚乳酸-聚乙醇酸納米纖維膜制備以及性能表征[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（25）:4631-4635.

Preparation of timosaponin B-Ⅱnano fi ber membranes and preliminary study on its antitumor activity in vitro

HUO Zhong-hua, YIN Peng, HOU Le-wei, LV Sheng, HU Jun, CHU Zhu-ling, LUAN Rong-gang, HU Guo-qiang(Department of General Surgery, 454th Hospital of PLA, Nanjing 210002, China)

Objective:To explore the preparation method of timosaponin B-Ⅱnanofiber membrane, in order to lay a foundation for the subsequent studies in vivo.Methods:Timosaponin B-Ⅱand PLLA at different ratios were made into timosaponin nano fi ber membranes; the surface structure and morphology of the drug loaded nano fi ber membranes were observed by scanning electron microscopy; the infrared spectra was adopted to determine the compatibility between the drug and the polymer; LC-MS/MS was used to measure timosaponin B-Ⅱlevels in solutions at different time points to draw the drug release curves; CCK-8 assay was used to detect the proliferative activity of tumor cells, in order to evaluate whether the sustained drug release from the drug-loaded nano- fi lms could inhibit the proliferation of gastric carcinoma cells.Results:The optimum concentration of timosaponin B-Ⅱfor drug loading was 12%; the electrospinning technique in the preparation of timosaponin B-Ⅱloaded nanofibers could maintain the physical and chemical properties of the both components; timosaponin B-Ⅱhad little effect on the thermal stability of fiber membranes, indicating a good compatibility; the timosaponin B-Ⅱnano fi ber membranes could effectively release timosaponin B-Ⅱin the conventional culture solution, the timosaponin B-Ⅱloaded nano fi ber membranes can inhibit the proliferation of BGC-823 cells signi fi cantly, the differences in the treated groups at 48 hours and 72 hours were signi fi cant (P ＜ 0.05) compared with the control group.Conclusion:Timosaponin B-Ⅱnano fi ber membranes can effectively inhibit the proliferation of BGC-823 cells through the sustained release of the drug.

Nano fi ber membrane; Sustained drug release; Antitumor; Timosaponin B-Ⅱ

R969.1

A

1672 – 8157(2014)02 – 0077 – 05

2013-09-15

2014-02-17）

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科研基金（12mb020）

霍中華，男，主任醫(yī)師，研究方向:肝膽外科。E-mail:qyan1971@126.com