胖大海提取液阻斷草酸鈣結(jié)石形成的實(shí)驗(yàn)研究

王潤(rùn)霞 王秀芳 沈玉華 魯文勝

（1 安徽師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

（2 安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，安徽 合肥 230601）

（3 安徽建筑大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230601）

（4 安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230039）

（5巢湖學(xué)院化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 238000）

尿結(jié)石是泌尿系統(tǒng)各部位結(jié)石病的總稱(chēng)，是泌尿系統(tǒng)的常見(jiàn)病。尿結(jié)石實(shí)際上某些物質(zhì)在人體發(fā)生了異常礦化，是一種生物礦石[1]，其中70-80%的晶體成分為草酸鈣（CaOxa），它的存在有三種形式：一水草酸鈣（CaOxa·H2O，COM）、二水草 酸 鈣 （CaOxa·2H2O，COD） 和三 水 草 酸 鈣（CaOxa·3H2O，COT），COM 熱力學(xué)最穩(wěn)定， 其次是COD，最不穩(wěn)定的是COT。由于COM熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)較高，因此約70%以上的草酸鈣結(jié)石是這種晶型[2]。尿結(jié)石發(fā)病率、復(fù)發(fā)率較高[1]，如何預(yù)防尿結(jié)石的形成是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。

研究表明，許多植物藥已經(jīng)成為預(yù)防和治療尿結(jié)石的重要醫(yī)療手段，因?yàn)槠鋵?duì)尿結(jié)石有預(yù)防和治療效果且具有信價(jià)比較高、副作用較小的優(yōu)點(diǎn)[3]。

目前，我國(guó)治療泌尿結(jié)石已嘗試采用中草藥方劑的方法，并對(duì)其治療機(jī)制進(jìn)行了初步的探索[4-9]。 中藥胖大海（sterculia scaphigera）又名大海子、通大海、大洞果、安南子、大發(fā)等，為梧桐科蘋(píng)婆屬燈籽萍婆的成熟種子，主產(chǎn)于東南亞，其中老撾產(chǎn)量最大，經(jīng)引種栽培，廣東、海南島亦產(chǎn)[10-12]，是傳統(tǒng)的清咽利喉的藥食兩用藥材。曾有文獻(xiàn)報(bào)道[13]胖大海阻斷草酸鈣結(jié)晶形成的臨床觀察，但對(duì)其阻斷機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本論文研究了單味中藥胖大海不同濃度的提取液對(duì)正常人體尿液中草酸鈣晶體生長(zhǎng)的影響及其化學(xué)基礎(chǔ)，這將為胖大海在臨床上作為防治尿結(jié)石的有效藥物提供理論的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

分析純草酸鈉 （常州蘇杭精細(xì)化工有限公司），分析純無(wú)水氯化鈣（章丘市魯洪化工有限公司），水為二次水。胖大海為廣東所產(chǎn)。

1.2 儀器

掃描電子顯微鏡（SEM）為日立牌S4800型，加速電壓0.1～30KV；用 MAP18XAHF型X-射線衍射儀進(jìn)行物相測(cè)試，掃描速度40/min；用德國(guó)Bruker公司生產(chǎn)的Equinox55型傅立葉變換紅外吸收光譜儀測(cè)試樣品的紅外光譜；用北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司生產(chǎn)的GT10-1型高速臺(tái)式離心機(jī)進(jìn)行離心操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 尿液處理

將質(zhì)量濃度為2%的疊氮化鈉溶液0.5ml加在收集的正常人尿液200ml中，以防止尿液變質(zhì)。之后，過(guò)濾尿液，在濾液中加入200ml生理鹽水稀釋?zhuān)瑪嚢杈鶆蚝蟠谩?/p>

1.3.2 胖大海提取液的制備

秤取胖大海100g于砂鍋中，加入二次蒸餾水4000ml，煮沸60分鐘，進(jìn)行過(guò)濾，將濾液收集。再加4000ml二次蒸餾水于留有濾渣的砂鍋內(nèi)，煮沸40分鐘，再進(jìn)行過(guò)濾，將濾液收集。將兩次濾液進(jìn)行合并，繼續(xù)煮沸濃縮，分別濃縮成含生藥 0.1g·ml-1，0.2g·ml-1，0.5g·ml-1，1.0g·ml-1的胖大海提取液，并將轉(zhuǎn)速調(diào)整為11000轉(zhuǎn)/分，分別用高速離心機(jī)進(jìn)行離心，取出上面的清液備用。

1.3.3 胖大海提取液對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)

將 50ml 5mmol·L-1的 Na2C2O4溶液、25ml經(jīng)處理的尿液、50ml 5mmol·L-1的 CaCl2溶液和50ml二次蒸餾水依次加入一只潔凈的燒杯中，攪拌均勻，經(jīng)24h靜置陳化后離心分離，所得樣品干燥后待測(cè)。 分別用含生藥 0.1g·ml-1、0.2g·ml-1、0.5g·ml-1、1.0g·ml-1的胖大海提取液替換二次水，同法操作，所得樣品干燥后分別用掃描電子顯微鏡（SEM）、X-射線衍射儀、紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度的胖大海提取液對(duì)草酸鈣晶體生成的影響

2.1.1 樣品的SEM表征

圖1 不同濃度胖大海提取液中草酸鈣的SEM圖

圖1為通過(guò)掃描電鏡觀察到的草酸鈣晶體在不同條件下形成的形貌。未加胖大海提取液時(shí)尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體為不規(guī)則的六邊形片狀結(jié)構(gòu)（圖 1a）；當(dāng)加入 0.1g·ml-1有兩種形貌（圖1b），一種是大小不一的不規(guī)則的六邊形片狀結(jié)構(gòu)，另一種是四方錐形晶體；當(dāng)加入0.2g·m l-1胖大海提取液后尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體（圖1c），與圖1b相似，也有兩種形貌；當(dāng)加入0.5g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體為大小均勻的四方錐形晶體（圖 1d）；加入 1.0g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體為四角雙錐柱形（圖1e）。由于COM型晶體是六邊形片狀結(jié)構(gòu)[14]，COD晶體形狀為四方錐形[15]，可以判斷，未加胖大海提取液的尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體為 COM 型；當(dāng)分別加入 0.1g·ml-1、0.2g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體是COM與COD共存的草酸鈣晶體；當(dāng)分別加入0.5g·ml-1、1.0g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體為COD型晶體，同時(shí)比較圖1d、1e，可以看出，加入1.0g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體體積（柱體長(zhǎng)約為1.5μm）比加入0.5g·ml-1胖大海提取液后尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體體積（平均邊長(zhǎng)約2.5μm）小。從以上討論推測(cè)，胖大海提取液對(duì)尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的影響是隨著胖大海提取液濃度增大，草酸鈣晶體以COD晶體存在的趨勢(shì)增大，所得COD晶體尺寸隨之減小。因此可以判斷胖大海提取液能阻斷尿液中生長(zhǎng)的向COM晶體轉(zhuǎn)化，且能減小COD晶體尺寸。

2.1.2 樣品的FTIR光譜

圖2 不同濃度胖大海提取液中草酸鈣的FTIR譜圖

圖2為不同濃度胖大海提取液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FT-IR譜圖。未加胖大海提取液時(shí)，生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FT-IR光譜圖 （圖 2a）顯示，COO-的伸縮振動(dòng)帶 ν（COO-）為 1325cm-1，反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)帶 νas（COO-） 在 1615cm-1和1670cm-1處出現(xiàn)雙峰；圖 2b是在加入0.1g·ml-1胖大海提取液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FT-IR光譜，COO-的伸縮振動(dòng)帶 ν（COO-）為 1325cm-1，νas（COO-） 在 1618cm-1和 1650cm-1處出現(xiàn)雙峰，并在655cm-1和620cm-1處又出現(xiàn)雙峰；在加入0.5g·ml-1胖大海提取液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FT-IR 光譜（圖 2c）顯示，1325cm-1為 COO-的伸縮振動(dòng)帶 ν（COO-），在 1618cm-1和 1660cm-1處的雙峰為 νas（COO-），在 618cm-1處出現(xiàn)指紋區(qū)特征峰；當(dāng)加入1.0g·ml-1胖大海提取液時(shí)，尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FT-IR光譜（圖 2d）顯示，1325cm-1為 COO-的伸縮振動(dòng)帶 ν （COO-），在1620cm-1和 1655cm-1的雙峰為 νas（COO-），在指紋區(qū)特征峰出現(xiàn)在618cm-1處。由于COM晶體的COO-的伸縮振動(dòng)帶 ν（COO-）為 1325cm-1，反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)帶νas（COO-）雙峰位置為 1615cm-1、1670cm-1，特征峰為655cm-1；COD晶體的COO-的伸縮振動(dòng)帶 ν（COO-）為 1325cm-1，反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)帶 νas （COO-） 雙峰位置為 1618cm-1、1655～1660cm-1、特征峰為 618～620cm-1[16]，因此，可以推測(cè)當(dāng)未加胖大海提取液的尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體為COM晶體； 當(dāng)分別加入 0.1g·m l-1、0.5g·ml-1胖大海提取液時(shí)，尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體為COM和COD共存的晶體；當(dāng)加入的胖大海提取液濃度達(dá)到一定量，如達(dá)到1.0g·ml-1時(shí)，尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體主要COD晶體，與SEM推測(cè)結(jié)果一致。

2.1.3 不同濃度胖大海提取液條件下的草酸鈣晶體的XRD圖

圖3 加入不同濃度胖大海提取液后尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的XRD圖譜

圖3為在不同濃度胖大海提取液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的XRD圖譜。尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體在未加胖大海提取液時(shí)的XRD譜（圖3a）顯示，位于 15.08°，24.44°和 30.20°處的衍射峰分別對(duì)應(yīng)于COM晶體（JCPDS卡片號(hào)：20-0231）的（01）、（020）和（02）晶面；圖 3b 為加入 0.1g·ml-1的胖大海提取液后生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的XRD譜，2θ 為 14.22°，19.90°，32.22，37.16°和 40.23°處的衍射峰分別對(duì)應(yīng)于COD晶體（JCPDS卡片號(hào)：17-0541）的（200），（211），（411），（103）和（213）晶面，因此，可以推測(cè)，未加胖大海提取液在尿液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體為COM晶型；加入濃度為0.1g·m l-1的胖大海提取液后生長(zhǎng)的草酸鈣以COM、COD兩種晶型共同存在；圖3c與圖3b比較發(fā)現(xiàn)圖3c中COM型晶體的衍射峰除（020）面衍射峰外，其它衍射峰基本消失，表明此時(shí)草酸鈣晶體主要以COD晶型存在，還有少量COM晶型存在；而圖3d與圖3c比較，則與其相似，表明此時(shí)所得草酸鈣晶體也主要為COD型；圖3e與圖3c、圖3d相似，但COD型晶體的衍射峰明顯增強(qiáng)，表明此時(shí)所得草酸鈣晶體也主要為COD型。以上結(jié)果與SEM圖及FTIR光譜推測(cè)的結(jié)果吻合。

2.2 胖大海提取液對(duì)草酸鈣結(jié)晶影響的機(jī)理探討

圖4 胖大海提取液的紅外光譜

在500～3000cm-1范圍內(nèi)，用KBr壓片法分別測(cè)定胖大海提取液、胖大海提取液與CaCl2溶液的混合液的紅外光譜，見(jiàn)圖4。由圖4a中可以看出位于1650cm-1、1410cm-1處有吸收峰，從有機(jī)基團(tuán)紅外光譜圖譜所查，得知位于1650cm-1處的吸收峰是νsC=O的伸縮振動(dòng)，1410cm-1處的吸收峰是νC-OH的振動(dòng)峰，這是由于胖大海提取液中含有阿拉伯糖、半乳糖等多糖[18]的原因。從胖大海提取液與CaCl2溶液混合液的紅外光譜圖（圖4b）可看出，胖大海提取液中加入CaCl2溶液后，νsC=O的伸縮振動(dòng)峰及νC-OH的振動(dòng)峰發(fā)生變化，向高頻移動(dòng)，分別移至1660 cm-1和1450cm-1。這可能是由于胖大海提取液中多糖的羥基、羰基等通過(guò)配位作用與Ca2+結(jié)合形成可溶性配位化合物，降低了Ca2+與Oxa2-的結(jié)合能力，使得CaOxa的成核和生長(zhǎng)被抑制。

3 結(jié)論

COM型草酸鈣晶體熱穩(wěn)定性比COD型強(qiáng)，只有使用添加劑將COD全部覆蓋，COD在尿液溶液中才能不轉(zhuǎn)化為COM型晶體[17]。因此，本論文實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)加入胖大海提取液濃度較?。ā苡?.1g·ml-1）時(shí)，COD晶面不能全部被其有效成分多糖分子包裹，因而COD轉(zhuǎn)變?yōu)镃OM的趨勢(shì)不能完全被阻斷，故COM和COD兩種晶型會(huì)共同存在。當(dāng)胖大海提取液濃度足夠大（≥0.5g·ml-1）時(shí)，其有效成分多糖分子與COD的吸附鍵合點(diǎn)較多，COD晶面可能全部被其有效成分多糖分子包裹，導(dǎo)致COD轉(zhuǎn)變?yōu)镃OM受阻，則形成的草酸鈣晶體主要為COD型。

胖大海提取液中的阿拉伯糖、半乳糖等有機(jī)分子能夠使草酸鈣亞穩(wěn)溶液中的可溶性Ca2+離子濃度增加，使COM晶體的生長(zhǎng)受到阻斷，從而減少了COM晶體的聚集，并且由于胖大海提取液含有的多糖的羰基和羥基與Ca2+配合，通過(guò)配位平衡覆蓋了COD晶體，阻斷其轉(zhuǎn)化為COM晶體，使COD晶體相對(duì)穩(wěn)定，并且這種阻斷作用隨著胖大海提取液濃度增大而增大。由于COD型晶體與腎小管細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合力較小，易于隨尿液排出體外，故胖大海提取液能阻斷COD晶體轉(zhuǎn)化為COM晶體的作用實(shí)際上也就是減小草酸鈣與尿路細(xì)胞膜粘附的作用，進(jìn)而有利于阻斷草酸鈣結(jié)石的形成。這個(gè)結(jié)果表明，胖大海除可以作為清咽利喉藥材外，還可以作為防治草酸鈣結(jié)石的藥食兩用藥材。

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