HPLC測定六神曲中青蒿素、蘆丁和槲皮素含量

謝彥博，徐云，孫盛，相宏宇，劉洪章*，謝秋宏*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130033；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）

HPLC測定六神曲中青蒿素、蘆丁和槲皮素含量

謝彥博1，徐云2，孫盛2，相宏宇2，劉洪章1*，謝秋宏2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130033；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）

本研究建立了高效液相色譜法測定六神曲中青蒿素、蘆丁和槲皮素成分含量的方法。采用Acchrom XAqua C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）。測定青蒿素含量時，用柱前衍生方法，以乙腈-水（60∶40）為流動相；流速0.8 mL/min，紫外檢測波長為260 nm，柱溫35℃。測定蘆丁和槲皮素含量時，以甲醇-0.4%磷酸(50∶50)為流動相；紫外檢測波長分別為360 nm(蘆丁)和280 nm(槲皮素)；流速0.8 mL/min；柱溫30℃。結(jié)果青蒿素、蘆丁和槲皮素可以達(dá)到較好的分離。在選定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(青蒿素R2=0.9991，蘆丁R2=0.999 4，槲皮素R2=0.999 5)，平均回收率分別為98.6%，101.4%和97.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.65%，0.91%和1.46%(n=5)。該方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，為六神曲的質(zhì)量評價和控制提供了科學(xué)依據(jù)。

六神曲；青蒿素；蘆丁；槲皮素；高效液相色譜

六神曲（Massa Medicata Fermentata，MMF）又名神曲，是一味應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥曲劑，由辣蓼、青蒿、蒼耳、赤小豆、苦杏仁、麥麩和面粉按照一定比例混合后經(jīng)自然發(fā)酵制成[1]，具有健脾和胃、消食調(diào)中等功效[2]。六神曲各組分比例在《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第19冊有記載，其中面粉27.17%、麥麩54.34%、赤小豆1.1%、苦杏仁1.1%、辣蓼5.43%、青蒿5.43%、蒼耳草5.43%?！吨袊幍洹?005年版中注明了六神曲的炮制方法[3]，從組分比例可以看出，青蒿、辣蓼、蒼耳是主要的藥用原料。

屠呦呦等[4]從青蒿中發(fā)現(xiàn)了青蒿素。青蒿素為具有過氧基團的新倍半萜內(nèi)酯，具有抗瘧、調(diào)節(jié)免疫功能、抗血吸蟲病和祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘，抑制病毒、細(xì)菌等作用[5]。辣蓼中含有蘆丁和槲皮素[6]。蘆丁又名蕓香苷，是天然的黃酮類化合物，維生素P的主要組分之一，具有抗炎止血和抑菌的功效[7]。槲皮素屬于黃酮類化合物，是自然界存在的最主要的食物黃酮醇類之一，可用于治療腹瀉、腸炎等癥狀[8]。青蒿素、蘆丁和槲皮素的功效體現(xiàn)了六神曲的功效。

目前六神曲的生產(chǎn)大部分為小作坊式，且市場混亂。各廠家生產(chǎn)配方不統(tǒng)一，對六神曲的質(zhì)量評價主要通過感官和經(jīng)驗，沒有可量化的統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此難以控制和評價六神曲的質(zhì)量[10]。在六神曲的研究方面，主要集中在對六神曲中的消化酶、發(fā)酵機制和微生物的研究[11-14]。

由于青蒿和辣蓼是六神曲的主要中藥組分，青蒿素、蘆丁和槲皮素的藥效體現(xiàn)了六神曲的主要藥效。為了探討青蒿素、蘆丁和槲皮素在六神曲中的含量是否可以作為六神曲質(zhì)量的評價指標(biāo)，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對多個產(chǎn)地的六神曲中的青蒿素、蘆丁和槲皮素的含量進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)果表明，它們是六神曲中的重要指標(biāo)，并建立了HPLC測定六神曲中此三種成分的方法。這些成果為制定六神曲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：Fisher色譜試劑公司；水為高純水，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。青蒿素對照品：中國藥品生物制品檢定所，批號為100202-201004；槲皮素、蘆丁對照品：上海源葉生物科技有限公司，批號分別為YA0806YB13和20140416；7種六神曲生品分別購自7個具有代表性的產(chǎn)地（山東臨沂、陜西漢中、安徽亳州、河北保定、河北安國、四川成都和安徽合肥），并經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院武毅教授鑒定。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀（2489雙波長紫外檢測器）：北京京科瑞達(dá)科技有限公司；Acchrom XAqua C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：北京華譜新創(chuàng)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

青蒿素測定：流動相水-乙腈（40∶60）；檢測波長260 nm；流速0.8 mL/min；柱溫35℃。蘆丁和槲皮素測定：流動相甲醇-0.4%磷酸（50∶50）；檢測波長分別為360 nm（蘆?。┖?80 nm（槲皮素）；流速0.8 mL/min；柱溫30℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精確稱取青蒿素10.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇完全溶解，并于100.0 mL容量瓶中定容，即得0.1 mg/mL的青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。青蒿素生成衍生物Q260的反應(yīng)原理如圖1所示。精確移取青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL于50.0 mL容量瓶中，加入14 mL 0.2%NaOH溶液，置于45℃水浴中反應(yīng)30 min，流水冷卻至室溫，加入8 mL 0.08 mol/L的醋酸溶液，充分反應(yīng)后，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇定容，搖勻，即為Q260標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精確稱取蘆丁13.0 mg及槲皮素10.0 mg，分別于100.0 mL容量瓶中用甲醇充分溶解并定容，搖勻，即得蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

圖1 青蒿素柱前衍生過程[15]Fig.1 Pre-column derivatization process of artemisinin[15]

1.3.3 供試品的制備

樣品中青蒿素的提取，精確稱取20.0 g六神曲于錐形瓶中，加入60 mL石油醚，置于磁力攪拌加熱器上恒溫50℃加熱攪拌提取2 h，離心取上清，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50℃蒸干，用適量體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇將濃縮物全部溶解并定容至10 mL，得青蒿素供試品溶液。Q260供試品溶液制備方法參見“1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品的制備”。

樣品中蘆丁和槲皮素的提取，精確稱取20.0 g六神曲于錐形瓶中，加入60 mL無水乙醇，40℃超聲30 min，離心取上清，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40℃蒸干，用適量甲醇將濃縮物全部溶解并定容至10 mL，即為蘆丁和槲皮素的供試品溶液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

青蒿素衍生物標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度分別為2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度分別為13μg/mL、65μg/mL、130μg/mL、195μg/mL、260 μg/mL，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度分別為50 μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL，進(jìn)樣10μL，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品及供試品的高效液相色譜圖

各對照品、供試品經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，其青蒿素、蘆丁及槲皮素的HPLC圖如圖2所示。

圖2 對照品(A)和樣品(B)HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A)and samples(B)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程建立

按照1.3.4節(jié)方法，分別制備5個不同質(zhì)量濃度的青蒿素、蘆丁及槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣10 μL，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 青蒿素(A)、蘆丁(B)及槲皮素(C)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of artemisinin(A),rutin(B)and quercetin(C)

將標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，得青蒿素回歸方程：Y= 29.914X-15.548，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1；蘆丁回歸方程：Y= 11.538X+17.607，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4；槲皮素回歸方程：Y=6.871X-92.655，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。

2.3 精密度試驗

分別取青蒿素、蘆丁和槲皮素供試品溶液各一份，每份樣品連續(xù)進(jìn)樣5針，測得青蒿素、蘆丁和槲皮素的峰面積值并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表1。

由表1可知，青蒿素RSD為0.97%，蘆丁RSD為0.83%，槲皮素RSD為0.87%，均＜5%，表明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗結(jié)果Table 1 Results of precision tests

2.4 穩(wěn)定性試驗

分別取青蒿素、蘆丁和槲皮素供試品溶液各一份，分別于0、2 h、6 h、12 h、24 h進(jìn)樣，分別測定青蒿素、蘆丁和槲皮素的峰面積值并計算RSD，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Results of stability tests

由表2可知，青蒿素RSD為0.93%，蘆丁RSD為0.85%，槲皮素RSD為0.90%，均＜5%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗

精密稱取同批六神曲藥材10份，按照供試品溶液的制備方法，5份制得青蒿素衍生物供試品，5份制得蘆丁和槲皮素供試品，并進(jìn)樣，分別測定青蒿素、蘆丁和槲皮素的峰面積值并計算RSD，結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Results of repeatability tests

由表3可知，青蒿素RSD為1.02%，蘆丁RSD為0.90%，槲皮素RSD為0.96%，均＜5%，表明重現(xiàn)性較好。

2.6 加樣回收率試驗

取已知青蒿素、蘆丁和槲皮素含量的六神曲藥材15份，每份0.5 g，精密稱量，然后將其分為3組，每組中精確加入對照品的量相當(dāng)于各成分含量的80%、90%、100%、110%、120%，并分別測定青蒿素、蘆丁和槲皮素的峰面積值，計算青蒿素、蘆丁和槲皮素的平均回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果(n=5)Table 4 Results of added sample recovery tests(n=5)

由表4可知，青蒿素平均回收率為98.6%（RSD為1.65%），蘆丁平均回收率為101.4%（RSD為0.91%），槲皮素平均回收率為97.2%（RSD為1.46%），說明該方法準(zhǔn)確度高。

2.7 六神曲中青蒿素、蘆丁和槲皮素含量的測定

對7個產(chǎn)地的六神曲藥材，按供試品制備方法制備，并精密進(jìn)樣10 μL，測得青蒿素、蘆丁和槲皮素的含量，測定結(jié)果見表5。

由表5可知，產(chǎn)地四川成都六神曲中含有青蒿素18.45μg/g，蘆丁66.46 μg/g和槲皮素3.80 μg/g。產(chǎn)地安徽亳州六神曲中含有青蒿素7.73μg/g，蘆丁61.30μg/g和槲皮素7.23 μg/g。兩個產(chǎn)地六神曲中三種有效成分含量均較高，而其他產(chǎn)地的含量波動較大，特別是蘆丁和槲皮素含量差異巨大，說明各產(chǎn)地成品的差異外，也說明配方及工藝控制的不同。經(jīng)過市場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四川成都是全國12家獲批生產(chǎn)六神曲的企業(yè)之一，安徽亳州則是目前市場上最大貨源地，這兩家六神曲的生產(chǎn)控制和成品質(zhì)量有保障；而其他產(chǎn)地以作坊居多，其品質(zhì)控制方面存在薄弱環(huán)節(jié)。

表5 7個產(chǎn)地六神曲中青蒿素、蘆丁和槲皮素的含量測定Table 5 Artemisinin,rutin and quercetin analysis in Massa Medicata Fermentata collected from 7 regions

3 結(jié)論

通過HPLC檢測并定量發(fā)酵中藥六神曲中青蒿素、蘆丁和槲皮素的含量。通過對精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率的檢測，在選定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（青蒿素R2=0.999 1，蘆丁R2=0.999 4，槲皮素R2=0.999 5），平均回收率分別為98.6%，101.4%和97.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.65%，0.91%和1.46%（n=5）。證明該方法簡單易行，靈敏度高。作為六神曲原材料中的主要中草藥，青蒿素是青蒿的主要成分，蘆丁和槲皮素是辣蓼的主要成分。它們不僅是六神曲成品的主要藥效成分，同時其含量也間接反映原材料中青蒿和辣蓼占的比重。

結(jié)果表明，青蒿和辣蓼在六神曲中的比重對其成品品質(zhì)具有一定的主導(dǎo)作用，青蒿素、蘆丁和槲皮素在六神曲中的含量可以作為六神曲質(zhì)量評價的依據(jù)。HPLC法也是目前中藥成分分析的主要方法，本研究結(jié)果可為六神曲的質(zhì)量控制和評價提供依據(jù)。

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Determination of artemisinin,rutin and quercetin in Massa Medicata Fermentata by HPLC

XIE Yanbo1,XU Yun2,SUN Sheng2,XIANG Hongyu2,LIU Hongzhang1*,XIE Qiuhong2*
(
1.School of Life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun 130033,China; 2.School of Life Sciences,Jilin University,Changchun 130012,China)

HPLC method was described for determining the contents of artemisinin,rutin and quercetin in Massa Medicata Fermentata(MMF).Chromatography separation was performed on HPLC system with Acchrom XAqua C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)column.Artemisinin was determined with the method of pre-column reaction and isocratic elution with mobile phase acetonitrile/water(60∶40),the flow rate was 0.8 ml/min,and UV detection wavelength and temperature was 260 nm and 35℃,respectively.Rutin and quercetin were determined under the condition of mobile phase methanol/0.4%phosphoric acid(50∶50),flow rate 0.8 ml/min,temperature 30℃,detection wavelength 360 nm for rutin and 280 nm for quercetin, respectively.The results indicated that the separation of artemisinin,rutin and quercetin was good.A good linearity was observed in the selected concentration range(artemisinin R2=0.999 1,rutin R2=0.999 4 and quercetin R2=0.999 5).The average recoveries of the three compounds were 98.6% (RSD 1.65%),101.4%(RSD 0.91%)and 97.2%(RSD 1.46%)(n=5),respectively.The method was simple with good accuracy and reproductivity and it can be applied for quality evaluation and control for Massa Medicata Fermentata.

Massa Medicata Fermentata;artemisinin;rutin:quercetin;HPLC

R282.71

A

0254-5071（2014）10-0140-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.034

2014-09-12

吉林省科技廳醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項目（20130727036YY）；吉林省科技廳重大科技攻關(guān)項目（20140203001YY，20140203024NY）；重點攻關(guān)項目（20130206009SF）

謝彥博（1988-），男，碩士研究生，研究方向為生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究。

*通訊作者：謝秋宏（1967-），女，教授，博士，研究方向為微生物與生化藥學(xué)。

劉洪章（1957-），男，教授，博士，研究方向為生物藥資源。