不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌群落的研究

杜禮泉，羅惠波，黃治國，茍?jiān)屏?，賀新生*，王遠(yuǎn)成，饒家權(quán)，王曉剛，范昌明，唐聰

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010；2.四川省綿陽市豐谷酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川綿陽621000；3.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌群落的研究

杜禮泉1，2，羅惠波3，黃治國3，茍?jiān)屏?，賀新生1*，王遠(yuǎn)成2，饒家權(quán)2，王曉剛2，范昌明2，唐聰2

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010；2.四川省綿陽市豐谷酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川綿陽621000；3.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合變性梯度凝膠電泳指紋分析技術(shù)（PCR-DGGE），對(duì)不同質(zhì)量窖泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，從微生物角度說明了不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌種群的復(fù)雜性，同時(shí)，鑒定出了常見的芽孢桿菌、醋酸桿菌等微生物，以及發(fā)現(xiàn)可能的新菌種和尚未在窖泥研究中報(bào)道的瘤胃球菌。以質(zhì)量最好的窖泥為參照，其他窖泥的質(zhì)量與其跟參照窖泥的細(xì)菌群落間相似性指數(shù)總體呈正相關(guān)。這一規(guī)律為今后研究窖泥培養(yǎng)、養(yǎng)護(hù)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

濃香型白酒；窖泥；細(xì)菌群落

在濃香型白酒生產(chǎn)中，質(zhì)量較好的窖泥生產(chǎn)酒的質(zhì)量較好，質(zhì)量較差的窖泥生產(chǎn)酒的質(zhì)量也較差，如何使窖泥盡快轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)質(zhì)窖泥以及使優(yōu)質(zhì)窖泥不退化是白酒行業(yè)長期以來的追求。

通過對(duì)不同質(zhì)量窖泥的研究，確定優(yōu)質(zhì)窖泥中微生物的種（群）、數(shù)量、所占比例以及在白酒釀造中的作用，為窖泥的培養(yǎng)、養(yǎng)護(hù)以及窖泥功能菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)，則成為窖泥微生物研究的重要內(nèi)容。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)技術(shù)在特殊微生態(tài)環(huán)境中微生物群落分析中已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[1-10]。但是，采用分子生物學(xué)的方法研究不同質(zhì)量窖泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其變化還未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合變性梯度凝膠電泳指紋分析技術(shù)（polymerase chain reactiondenaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE），對(duì)不同質(zhì)量窖泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及進(jìn)行分析，通過對(duì)窖泥細(xì)菌16S rDNA的克隆分析和DGGE圖譜比較，并對(duì)優(yōu)勢微生物進(jìn)行測序鑒定，對(duì)不同質(zhì)量窖泥中細(xì)菌群落的構(gòu)成有了更深入的認(rèn)識(shí)，為今后研究窖泥培養(yǎng)、養(yǎng)護(hù)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣品取自四川省綿陽市豐谷酒業(yè)有限責(zé)任公司白酒生產(chǎn)窖池，根據(jù)公司窖泥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別采集7個(gè)不同品質(zhì)窖泥樣品（窖池底部中央），混合，迅速用冰盒運(yùn)回，-20℃保藏。

7個(gè)不同品質(zhì)窖泥根據(jù)產(chǎn)質(zhì)量酒能力評(píng)分如下：1號(hào)：7.0分；2號(hào)：6.2分；3號(hào)：5.5分；4號(hào)：4.7分；5號(hào)：3.4分；6號(hào)：1.6分；7號(hào)：1.1分。窯泥產(chǎn)質(zhì)量酒能力計(jì)算公式為：N=（A× 0.4+B×0.3+C×0.2+D×0.1）×100；式中：N為窖泥產(chǎn)質(zhì)量酒能力，單位為“分”；A為所產(chǎn)調(diào)味酒的糧糟比；B為所產(chǎn)優(yōu)級(jí)酒的糧糟比；C為所產(chǎn)一級(jí)酒的糧糟比；D為所產(chǎn)二級(jí)酒的糧糟比；A、B、C、D數(shù)據(jù)均為最近一年平均值。N值越大，說明窖泥產(chǎn)質(zhì)量酒的能力越強(qiáng)，窖泥的質(zhì)量就越好。酒質(zhì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 酒質(zhì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standard of liquor quality

1.2 儀器與設(shè)備

DGGE電泳儀、My Cycler型PCR儀：美國BIORAD公司；通用型恒壓恒流電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Bio-Best 200E型凝膠成像分析系統(tǒng)：美國SIM公司；Universal 32R型高速冷凍離心機(jī)：德國Hettich公司；MX-S型可調(diào)式混勻儀、SK-L180-Pro型水平脫色搖床：美國賽洛捷克公司；SW-CG-1F型超凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 窖泥微生物總DNA的提取及檢測

微生物總DNA的提?。翰捎檬榛蛩徕c（sodium dodecyl sulfate，SDS）-酚抽提法[11]和DNA純收試劑盒相結(jié)合的方法提取窖泥中微生物總宏基因組。

細(xì)菌PCR擴(kuò)增：選用通用引物U968f-GC/L1401r[12-13]，可以擴(kuò)增出470 bp左右的片段。

PCR產(chǎn)物檢測：取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入1 μL 6× loading buffer混勻，取3 μL DL2000TM DNA Marker作對(duì)照。于1%瓊脂糖凝膠上140 V電泳25 min，溴化乙錠（ethidium bromide，EB)染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存。

1.3.2 窖泥PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳及圖像分析

窖泥PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用DGGE技術(shù)分析細(xì)菌群落的構(gòu)成。按比列配制高、低濃度的凝膠溶液（45%，65%，交聯(lián)度為38.97∶1.03，膠濃度為8%，其配制方法見表2）。電泳完畢用用含有SYBR-Green的1×TAE電泳緩沖液滴加到電泳膠上進(jìn)行染色，染色分三次進(jìn)行，每次15 min，拍照保存DGGE圖譜。采用Quantity One分析軟件進(jìn)行DGGE圖譜的多樣性指數(shù)、相似性指數(shù)分析。

表2 變性凝膠配方Table 2 Formulation of denaturing gel

1.3.3 DGGE條帶切膠條帶回收DNA以及PCR擴(kuò)增、測序

在凝膠成像儀上選取目標(biāo)條帶切膠條帶回收DNA，5 μL回收產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收純化，再通過DNA片段連接T載體，大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化進(jìn)行克隆。各樣品挑選克隆得到的白色菌落3個(gè)送至上海英濰捷基測序，測序引物為344f-GC/522r。測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行比對(duì)，確定對(duì)應(yīng)條帶種屬信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌16S rRNA V6-V8區(qū)基因的獲取

窯泥微生物總DNA進(jìn)行提取后，經(jīng)0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of bacteria in pit mud with different quality

2.2 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌16S rRNA V6-V8區(qū)基因DGGE電泳

為了將目標(biāo)片段最大程度的分離得到最優(yōu)的DGGE圖譜，則需要適合該樣品的電泳條件。目前很多文獻(xiàn)中所述的水平膠電泳電壓通常在90～200 V之間，時(shí)間為2～12 h，但是電泳時(shí)間過短不利于條帶的分離，本試驗(yàn)優(yōu)化之后使用電泳電壓為120 V，時(shí)間為12.5 h，電泳凝膠梯度最終確定變性梯度為45%～65%，電泳條帶得到了較好的分離，試驗(yàn)得到條帶清晰的DGGE圖譜（見圖2）。由圖2可知，每個(gè)樣品的16S rDNA PCR產(chǎn)物得到了較好的分離。

圖2 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌的DGGE圖譜Fig.2 DGGE pattern of the bacteria in pit mud with different quality

2.3 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌DGGE圖譜豐度及優(yōu)勢度的分析

豐度在圖譜上代表了每個(gè)泳道中有效的條帶，也可以認(rèn)為是表達(dá)了該條帶對(duì)應(yīng)樣品所表征出的物種數(shù)。

優(yōu)勢度表征了該物種在整個(gè)群落中所占比例大小，Quantity One在圖譜分析中可以進(jìn)行TIF分析（即灰度分析）以條帶相對(duì)質(zhì)量值得以體現(xiàn)，其值大小與條帶峰面積和明暗程度呈正比，在圖譜中則代表了相對(duì)應(yīng)條帶的優(yōu)勢度。

圖3 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌的DGGE電泳條帶位置比較圖Fig.3 Compare image of DGGE bands of the bacteria in pit mud with different quality

由圖3和表3可知，不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌的豐度值在11～22之間，表明不同質(zhì)量窖泥之間的細(xì)菌種群數(shù)差異很大，或者是在PCR表達(dá)過程中出現(xiàn)了一定的偏向性。同時(shí)，也可看出不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌的種群數(shù)都較豐富，但窖泥細(xì)菌的種群數(shù)與窖泥的質(zhì)量無相關(guān)性；通過對(duì)不同質(zhì)量窖泥的細(xì)菌DGGE圖譜優(yōu)勢度分析，1號(hào)、11號(hào)、13號(hào)條帶為不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌共有的條帶，但各條帶的優(yōu)勢度與窖泥的質(zhì)量無相關(guān)性。

表3 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌條帶豐度及優(yōu)勢度Table 3 Abundance and dominance of the bacterial strips in pit mud with different quality

2.4 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌DGGE圖譜的多樣性指數(shù)分析

圖4 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌DGGE圖譜的多樣性指數(shù)Fig.4 Diversity index of DGGE patterns of the bacteria in pit mud with different quality

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H值）包含兩個(gè)因素：（1）種類數(shù)目，即豐度值；（2）種類中個(gè)體分配上均勻性[14]。因此，窖泥多樣性指數(shù)的高低由窖泥微生物種類和均衡性共同決定。窖泥多樣性指數(shù)越高，窖泥中的生物多樣性就越高。

式中：H為Shannon-Wiener多樣性指數(shù)；pi為第i個(gè)條帶的優(yōu)勢度；S為每一個(gè)泳道的豐度值。

不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌DGGE圖譜的多樣性指數(shù)分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌DGGE圖譜的多樣性指數(shù)最低是0.72（3號(hào)窖泥），最高為1.65（1號(hào)窖泥），但不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌DGGE圖譜的多樣性指數(shù)與窖泥的質(zhì)量無相關(guān)性。

2.5 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌DGGE圖譜的相似性指數(shù)分析

實(shí)驗(yàn)通過Quantity One軟件對(duì)各個(gè)樣品之間的相似性進(jìn)行了分析，得出不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌群落之間的相似度見表4。

表4 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌群落間的索倫森配對(duì)相似性系數(shù)值Table 4 Sorenson pairwise similarity coefficient of the bacterial community in pit mud with different quality %

由表4可知，不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌群落之間的相似度為：以1號(hào)窖泥（本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)量最好的窖泥）為參照，其他窖泥的質(zhì)量與其跟參照窖泥的細(xì)菌群落間相似性指數(shù)總體呈正相關(guān)。

2.6 不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌DGGE優(yōu)勢條帶切膠回收及鑒定

表5 細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)基因的DGGE切膠條帶的測序結(jié)果分析Table 5 Sequencing results of the bands cut from the bacterial 16S rRNA V3 DGGE gels

DGGE電泳結(jié)束染色后選取了15個(gè)優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收，切膠回收條帶經(jīng)968f和1401r重新PCR后，將二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并連接到PGM-T載體上，載體轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選每個(gè)切膠條帶挑取約3個(gè)陽性單克隆送上海英濰捷基公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果只有11個(gè)條帶獲得序列并在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，相似率基本＞90%，比對(duì)結(jié)果（表5）顯示11個(gè)條帶所代表的細(xì)菌包括了常見的芽孢桿菌、醋酸桿菌等，也有在窖泥中未培養(yǎng)出的瘤胃球菌，條帶5沒有具體的菌種結(jié)果，只是表明為一類細(xì)菌，在本實(shí)驗(yàn)中5號(hào)條帶優(yōu)勢度也極為顯著，這可能是窖泥中還未發(fā)現(xiàn)的新菌種，可以進(jìn)一步進(jìn)行研究。

3 結(jié)論與展望

根據(jù)不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌DGGE圖譜豐度、優(yōu)勢度和多樣性指數(shù)的分析，可看出不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌的種群數(shù)都較豐富，既有共有細(xì)菌種群，也有部分窖泥才具有的特定細(xì)菌種群，窖泥細(xì)菌DGGE圖譜的豐度、多樣性指數(shù)、各條帶的優(yōu)勢度與窖泥的質(zhì)量無相關(guān)性，這從微生物角度說明了不同質(zhì)量窖泥中細(xì)菌種群的復(fù)雜性。

根據(jù)不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌群落之間相似度的分析，發(fā)現(xiàn)以質(zhì)量最好的窖泥為參照，其他窖泥的質(zhì)量與其跟參照窖泥的細(xì)菌群落間相似性指數(shù)總體呈正相關(guān)，即窖泥質(zhì)量越好，表現(xiàn)為其與最優(yōu)質(zhì)參照窖泥的細(xì)菌群落間相似性指數(shù)越高。

根據(jù)不同質(zhì)量窖泥部分細(xì)菌鑒定結(jié)果的分析，包括了常見的芽孢桿菌、醋酸桿菌等微生物[15]，表明窖池中的細(xì)菌種類很豐富，其中的有些細(xì)菌是互利共生的關(guān)系，也有的細(xì)菌與古菌也存在互利共生的關(guān)系[16]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中條帶5沒有具體的菌種結(jié)果，可能是窖泥中還未發(fā)現(xiàn)的新菌種，有必要進(jìn)一步進(jìn)行研究，鑒定的瘤胃球菌尚未在窖泥研究中有所報(bào)道，對(duì)豐富濃香型白酒窖池中細(xì)菌類的信息有一定作用。

本實(shí)驗(yàn)從微生物角度說明了不同質(zhì)量窖泥細(xì)菌種群的復(fù)雜性，以及本實(shí)驗(yàn)在窖泥細(xì)菌方面的鑒定結(jié)果和新的發(fā)現(xiàn)，特別是發(fā)現(xiàn)以質(zhì)量最好的窖泥為參照，其他窖泥的質(zhì)量與其跟參照窖泥的細(xì)菌群落間相似性指數(shù)呈正相關(guān)這一規(guī)律，為今后研究窖泥培養(yǎng)、養(yǎng)護(hù)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Bacterial community in pit muds with different quality

DU Liquan1,2,LUO Huibo3,HUANG Zhiguo3,GOU Yunling2,HE Xinsheng1*,WANG Yuancheng2,RAO Jiaquan2, WANG Xiaogang2,FAN Changming2,TANG Cong2
(1.School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China; 2.Forgood Liquor Industry Co.,Ltd.,Mianyang 621000,China; 3.School of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China)

The bacterial community in pit muds with different quality was analyzed by polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE).The complexity of their bacterial community structures was illustrated from the microbial point of view.At the same time,common Bacillus spp.,Acetobacter spp.and other microbes were identified,as well as new species and not reported Rumen aureus in the study of pit mud were discovered.Using the optimal pit mud as reference,the relationship between other pit mud quality and their similarity index between bacterial community and the reference was in positive correlation.The result provided a theoretical basis for study of pit mud culture,maintain and application in the future.

Luzhou-flavor liquor;pit mud;bacterial community

TS261.1

A

0254-5071（2014）10-0113-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.027

2014-07-24

綿陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目（12CGZH15）

杜禮泉（1975-），男，高級(jí)工程師，碩士研究生，主要從事白酒生產(chǎn)工藝與釀酒微生物的研究工作。

*通訊作者：賀新生（1965-），男，教授，本科，主要從事菌物資源研究工作。