獼猴桃灰霉病生防真菌的分離與鑒定

畢金麗，崔艷麗，張靜，袁青峰，劉婭*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉831100；3.兵團(tuán)第十三師農(nóng)科所，新疆哈密839000）

獼猴桃灰霉病生防真菌的分離與鑒定

畢金麗1，崔艷麗2，張靜3，袁青峰3，劉婭1*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉831100；3.兵團(tuán)第十三師農(nóng)科所，新疆哈密839000）

為了獲得對(duì)獼猴桃灰霉病具有較高拮抗活性的生防菌株，采用系列稀釋法和平板涂布法從獼猴桃果園土壤和健康的獼猴桃果皮表面初步分離篩選到真菌20株；以導(dǎo)致灰霉病的灰霉菌為靶標(biāo)菌，經(jīng)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)5株真菌對(duì)灰霉病有一定拮抗作用，其中1株編號(hào)為HuW1的菌株抑菌直徑最寬，對(duì)灰霉病的抑制率最高，達(dá)80%左右，形態(tài)觀察和ITS rDNA、26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析表明該菌株為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

獼猴桃灰霉??；生物防治；拮抗真菌

果蔬采后病害導(dǎo)致的巨大經(jīng)濟(jì)損耗已成為一個(gè)全球關(guān)注的問(wèn)題。據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計(jì)，2011年我國(guó)約有1億多噸果蔬腐爛，直接損失高達(dá)1 000億元，占整個(gè)行業(yè)產(chǎn)值的30%以上，而美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家的果蔬采后損失率僅占1.7%～5%[1]。獼猴桃是國(guó)內(nèi)外重要的經(jīng)濟(jì)作物，獼猴桃灰霉病是由灰霉菌（Botrytis cinerea）引起的一種世界性的重要病害，能危害獼猴桃、蕃茄、草莓、黃瓜、葡萄等多種植物，引起果蔬腐爛，損失嚴(yán)重?；颐共【哂蟹敝晨?，遺傳變異大和適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，連續(xù)使用同一藥劑易產(chǎn)生抗藥性[2-3]。目前，果蔬采后病害的防治方法主要包括物理法和化學(xué)法，物理法生產(chǎn)成本太高，而化學(xué)殺菌劑處理存在一定的安全問(wèn)題[4]，帶來(lái)了嚴(yán)重的病菌抗藥性與環(huán)境污染問(wèn)題。而微生物防治可以有效的避免這些問(wèn)題的發(fā)生，隨著人們環(huán)保意識(shí)逐漸提高，對(duì)無(wú)公害果蔬的需求越來(lái)越大，微生物防治日益成為一條重要而有效的途徑[5]。本實(shí)驗(yàn)篩選對(duì)灰霉病有拮抗作用的真菌，從而為獼猴桃采后病害的生物防治提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土壤和獼猴桃果實(shí)

土壤樣品采自陜西獼猴桃灰霉病發(fā)生較重田塊的健康植株根圍土壤。取樣方法參考文獻(xiàn)[6]。

獼猴桃果實(shí)為成熟度好、大小均一、無(wú)病蟲(chóng)害的獼猴桃果實(shí)。獼猴桃用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉消毒3 min后用無(wú)菌水沖洗，自然晾干后備用[7]。

1.1.2 供試病原菌

病原菌分離于自然發(fā)病的獼猴桃果實(shí)，并經(jīng)過(guò)純化培養(yǎng)，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為灰霉菌（Botrytis cinerea）。將病原菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃滅菌20 min。

（2）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃滅菌20 min。

（3）酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母抽取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值，121℃滅菌20 min。配制YPD固體培養(yǎng)基時(shí)加入20 g的瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

“MLS-3780高壓蒸汽滅菌器、MDF-U53F超低溫冰箱：日本三洋公司；ZHJH-C1115C超凈工作臺(tái)、ZDP-A2160A全自動(dòng)新型電熱培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；S1000 PCR儀、Gel Dox XR+凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RAD公司；XSP-2C雙目生物顯微鏡：上海光學(xué)儀器廠；Centrifuge5430低溫離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；HWS-12數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海一恒儀器有限公司?！?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 真菌菌株分離純化與保存

土壤中真菌的分離采用平板涂布法。取適量土壤樣品于無(wú)菌水中，充分搖勻后用無(wú)菌水按照10倍稀釋度稀釋到不同梯度，涂布到PDA培養(yǎng)基，置于30℃靜置培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，將具有典型真菌菌落特征的單菌落挑出，進(jìn)行分離純化，鏡檢為純種后，于30℃連續(xù)傳代培養(yǎng)幾次[8]。對(duì)純化的菌株進(jìn)行編號(hào)，并保存在含有15%無(wú)菌甘油的凍存管中，-80℃保存。

獼猴桃果皮表面的真菌分離采用常規(guī)組織塊法[9]，培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基。在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，選取表面消毒、清洗后的獼猴桃表皮，切取成小塊（每邊長(zhǎng)3～4 cm），用無(wú)菌操作法將表皮組織移至平板培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，將具有典型真菌菌落特征的單菌落挑出，進(jìn)行分離純化，鏡檢為純種后，于30℃連續(xù)傳代培養(yǎng)幾次。對(duì)純化的菌株進(jìn)行編號(hào)，并保存在含有15%無(wú)菌甘油的凍存管中，-80℃保存。

1.3.2 拮抗真菌的篩選

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，以導(dǎo)致灰霉病的灰霉菌為靶標(biāo)菌，在PDA培養(yǎng)基平板上，靠近中央的位置，做兩個(gè)點(diǎn)標(biāo)記，距離4 cm左右，一個(gè)點(diǎn)接灰霉菌菌餅（直徑8 mm），并使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，另一點(diǎn)劃線篩選出的真菌，30℃培養(yǎng)24～72 h，測(cè)定菌落直徑，計(jì)算抑菌率[10-11]。設(shè)3次重復(fù)。同時(shí)以只接有灰霉病原菌的菌餅作為對(duì)照（CK）。

1.3.3 拮抗真菌的鑒定

對(duì)具有高拮抗活性的真菌，根據(jù)菌落特征，并利用光學(xué)顯微鏡觀察菌體，結(jié)合ITS rDNA和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析，確定其分類學(xué)地位[12-14]。

ITS序列擴(kuò)增引物為ITS1（5′-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3′），PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性、5 min；94℃變性、30 s，57℃退火、45 s，72℃延伸、1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃、10 min。26S rDNA D1/D2區(qū)域序列擴(kuò)增引物為NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′），PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性、5 min；94℃變性、30 s，55℃退火、45 s，72℃延伸、1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃、10 min。PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T Simple載體后進(jìn)行測(cè)序。所有序列的測(cè)定：由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。結(jié)合ITS序列和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列在NCBI的BLAST比對(duì)結(jié)果和菌落、菌體細(xì)胞形態(tài)對(duì)拮抗真菌進(jìn)行分類學(xué)鑒定[8，14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌菌株分離純化

以土壤和獼猴桃果皮表面為拮抗真菌篩選來(lái)源，經(jīng)初篩，共分離到20株真菌，其中源自土壤的菌株12株，源自獼猴桃果皮表面的菌株8株。

2.2 拮抗真菌的篩選

將分離到的20株真菌用于獼猴桃灰霉病潛在生防菌的篩選。分別在PDA培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過(guò)復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)有5株真菌對(duì)獼猴桃灰霉病具有一定的拮抗活性。根據(jù)平板對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中抑菌寬帶長(zhǎng)短，篩選出一株拮抗活性最高的菌株，編號(hào)為HuW1（源自獼猴桃果皮表面），其抑菌圈透明、邊緣清晰、界限明顯，且在接灰霉菌后的3 d內(nèi)具有一定的穩(wěn)定性，72 h后抑菌直徑達(dá)到33 mm左右，抑制率達(dá)80%左右，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌株HuW1與獼猴桃灰霉菌平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)效果Fig.1 Results of plate confrontation test between strain HuW1 and kiwi Botrytis cinerea

2.3 拮抗真菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定

菌株HuW1在PDA培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基上的菌落特征為菌落大且厚，表面濕潤(rùn)、透明、光滑、易被挑起，為乳白色，具有酵母菌落的典型特征，結(jié)果見(jiàn)圖2。

利用光學(xué)顯微鏡觀察菌株HuW1的菌體形態(tài)，菌體呈橢圓形，有子囊和孢子，具有酵母菌細(xì)胞的典型特征，如圖3所示。

圖2 菌株HuW1在PDA培養(yǎng)基(A)和YPD培養(yǎng)基(B)的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain HuW1 in PDA medium(A) and YPD medium(B)

圖3 菌株HuW1的細(xì)胞形態(tài)特征Fig.3 Cells morphology of strain HuW1

2.3.2 分子鑒定

HuW1 PCR擴(kuò)增獲得747 bp的ITS序列如下：

HuW1 PCR擴(kuò)增獲得615 bp的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列如下：

將所獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，ITS和26S r DNA D1/D2區(qū)域序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的Hanseniaspora uvarum和Hanseniaspora opuntiae的同源性為100%。

結(jié)合序列比對(duì)結(jié)果和菌落、菌體形態(tài)特征，最終將此菌株鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從健康的獼猴桃果皮表面分離到1株對(duì)灰霉病抑制效果較好的菌株HuW1，抑制率約為80%。經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

[1]宋金宇，劉程惠，胡文忠，等.拮抗酵母菌對(duì)果蔬病害防治的研究進(jìn)展[J].保鮮與加工，2012，12（5）：53-56.

[2]王克勤.灰霉病菌抗藥性研究進(jìn)展及防治對(duì)策[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000（5）：40-41.

[3]楊燕濤.國(guó)內(nèi)保護(hù)地蔬菜灰霉病侵染規(guī)律及防治技術(shù)研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥，2003，42（1）：6-10.

[4]全桂靜.蘋果采后病害拮抗細(xì)菌的篩選與防腐效果研究[J].貯藏保鮮加工，2013（11）：130-132.

[5]葛紹榮，牛莉娜，李銘.番茄灰霉病害及其微生物防治的研究進(jìn)展[J].生物加工過(guò)程，2007，5（3）：15-19.

[6]克龍啟，陸錚錚，吳石平，等.一株放線菌對(duì)辣椒青枯菌的拮抗作用及其鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（11）：92-95.

[7]鞏文峰，岳海梅，旺姆，等.酵母菌3SJ對(duì)三種蘋果致病菌的抑制效果及機(jī)理[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（13）：2741-2744.

[8]畢金麗，劉莉，張殿朋，等.耐高溫酵母的篩選鑒定及發(fā)酵性能的初步研究[J].中國(guó)釀造，2013，32（5）：107-110.

[9]方中達(dá)主編.植病研究法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[10]宋聰，李正國(guó)，邊萬(wàn)平，等.果實(shí)采后病害拮抗菌的篩選及鑒定[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，32（2）：76-81.

[11]耿海峰，張麗珍，牛偉.冬棗采后病害拮抗菌的篩選和鑒定[J].食品科學(xué)，2010，31（9）：150-155.

[12]燕勇，李衛(wèi)平，高雯潔，等.rDNA-ITS序列分析在真菌鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（10）：1958-1961.

[13]馬愛(ài)瑛.rDNA分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（32）：18079-18079.

[14]李鈞敏.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，2008.

[15]ZHANG M,XIAO Y,ZHU R R,et al.Enhanced thermotolerance and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae mutated by high-energy pulse electron beam and protoplast fusion[J].Bioprocess Biosyst Eng, 2012,35(9):1455-1465.

Isolation and identification of biocontrol fungi against kiwi Botrytis cinerea

BI Jinli1,CUI Yanli2,ZHANG Jing3,YUAN Qingfeng3,LIU Ya1*
(1.College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.XinJiang Agricultural Vocational and Technical College, Changji 831100,China;3.Institute of Agricultural Sciences of 13 Division Corps,Hami 839000,China)

In order to get bio-control strains with high antagonism activity against kiwi Botrytis cinerea,20 fungi strains were isolated and screened from kiwi fruit orchard soil and the surface of the health kiwi fruit by serial dilution method and spread plate method.Using B.cinerea as target strain,after affination of plate confrontation test,five strains with certain antagonistic activity against the growth of B.cinerea were found through the confrontation experiments.The bacteriostatic diameter of one strain named HuW1 was the widest,and the inhibition ratio against B.cinerea was about 80%.According to the BLAST results of ITS and 26S rDNA D1/D2 domain sequences and the morphology of the colony and cells,this strain was identified to be Hanseniaspora uvarum.

kiwi Botrytis cinerea;biocontrol;antagonistic fungi

S182

A

0254-5071（2014）10-0084-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.020

2014-05-19

兵團(tuán)博士資金專項(xiàng)（2014BB006）

畢金麗（1987-），女，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

*通訊作者：劉婭（1974-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。