Box-Behnken法優(yōu)化玉米秸稈預(yù)處理工藝對酶解糖化的影響

張莎莎，費(fèi)兆奎，薛冬樺

（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）

Box-Behnken法優(yōu)化玉米秸稈預(yù)處理工藝對酶解糖化的影響

張莎莎，費(fèi)兆奎，薛冬樺*

（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）

為促進(jìn)生物煉制產(chǎn)業(yè)發(fā)展，提高玉米秸稈酶解糖化效率，運(yùn)用Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化預(yù)處理工藝，研究硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和固液比四個因素對半纖維素水解率的影響規(guī)律，并結(jié)合掃描電子顯微鏡、紅外光譜儀、X-射線衍射儀分析玉米秸稈微觀形貌、結(jié)構(gòu)等指標(biāo)。結(jié)果表明：玉米秸稈預(yù)處理最佳工藝為反應(yīng)溫度100℃、硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%、反應(yīng)時間120 min、固液比1∶9（g∶mL），在此條件下半纖維素水解率為84.93%，木質(zhì)素脫除率為46.15%，預(yù)處理水解液還原糖質(zhì)量濃度為2.04 g/100 mL，木糖產(chǎn)率為74.22%，87.89%纖維素保留在固體部分，經(jīng)72 h酶解反應(yīng)酶解率達(dá)到85.79%，未處理玉米秸稈酶解率僅為32.25%。

玉米秸稈；酸催化；酶水解

生物煉制工業(yè)過程是利用可再生的有機(jī)物質(zhì)（包括農(nóng)作物、植物、畜禽糞便、有機(jī)廢棄物），通過工業(yè)加工轉(zhuǎn)化，進(jìn)行生物基產(chǎn)品、生物燃料和生物能源的生產(chǎn)[1]。玉米秸稈是潛在的生物資源，利用生物發(fā)酵技術(shù)將其轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖類，是當(dāng)前解決資源、能源及環(huán)境等問題的有效途徑。但玉米秸稈天然的抗降解結(jié)構(gòu)阻礙纖維素降解為可發(fā)酵性糖類[2-4]，尋找高效的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法，提高玉米秸稈酶解糖化效率，是解決這一問題的關(guān)鍵[5-7]。

美國國家可再生能源實驗室系統(tǒng)開展了玉米秸稈替代糧食生產(chǎn)燃料乙醇的研究[8]，丹麥瑞索國家實驗室系統(tǒng)研究玉米秸稈濕氧化預(yù)處理技術(shù)對玉米秸稈降解屏障影響[9]。北京非糧醇電聯(lián)產(chǎn)技術(shù)研發(fā)中心開展了玉米秸稈蒸汽爆破預(yù)處理研究[10]，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)開展了促進(jìn)玉米秸稈預(yù)處理效果的研究[11-12]，均表明預(yù)處理過程可提高玉米秸稈利用率。

開展以玉米秸稈為原料，運(yùn)用Box-Behnken法H2SO4催化水熱預(yù)處理玉米秸的研究，考察不同預(yù)處理條件下，玉米秸稈纖維素保留率，半纖維素水解率，木質(zhì)素的去除率以及預(yù)處理后固體部分的酶解效率。探討經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈底物成分變化和結(jié)構(gòu)變化，以及對可降解性能影響。揭示經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈在化學(xué)鍵，結(jié)晶度，微觀形貌和比表面積的變化，為玉米秸稈生物質(zhì)資源的有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

玉米秸稈由長春大成集團(tuán)實業(yè)有限公司提供，酶制劑來自諾維信公司。玉米秸稈原料組分經(jīng)近紅外分析：纖維素含量38.99%，半纖維素含量22.62%，木質(zhì)素含量14.47%，水分含量5.04%。將玉米秸稈篩，取0.2～0.4 mm的秸稈備用。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式攪拌器：金壇市科技儀器有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；NIRFlex N-400近紅外光譜儀：瑞士BUCHI公司；JSM-5500LV掃描電子顯微鏡：日本電子光學(xué)公司；Spectrum One傅立葉紅外光譜儀：美國PE公司；D/MAX 2000PC X-射線衍射儀：日本理學(xué)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

采用集熱式攪拌器預(yù)處理玉米秸稈，其升溫速率約為2～3℃/min，在不同的預(yù)處理條件下稀硫酸處理玉米秸稈，處理時間為系統(tǒng)到達(dá)目標(biāo)溫度后的保溫時間。反應(yīng)結(jié)束后，液體組分進(jìn)行還原糖分析，固體部分干燥，酶解備用。

1.3.2 中心組合設(shè)計試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)固液比作為Box-Behnken設(shè)計的自變量，半纖維素水解率為響應(yīng)值，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法優(yōu)化玉米秸稈預(yù)處理條件，進(jìn)行中心組合優(yōu)化試驗。因素水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平編碼Table 1 Factors and coded levels of Box-Behnken design

1.3.3 物料分析

利用傅里葉變換近紅外漫反射光譜（near infrared reflectance spectroscopy，NIRS）技術(shù)和化學(xué)計量學(xué)軟件，結(jié)合偏最小二乘法（partial least squares，PLS），通過光譜采集，進(jìn)行近紅外光譜模型預(yù)測及驗證，建立玉米秸稈全組分分析模型[13]。應(yīng)用近紅外光譜儀對玉米秸稈預(yù)處理前后物料中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量分析。還原糖含量采用DNS（3,5-二硝基水楊酸）法測定[14]，木糖含量采用間苯三酚法測定[15]。

玉米秸稈原料半纖維素含量為22.62%，經(jīng)預(yù)處理半纖維素全部轉(zhuǎn)化為木糖，由方程計算木糖的理論產(chǎn)量25.70 g/100 g玉米秸稈[16]。

1.3.4 掃描電鏡分析

將預(yù)處理前后玉米秸稈經(jīng)過篩、干燥、表面鍍金處理，固定在操作臺，放大500倍進(jìn)行形貌掃描分析。

1.3.5 紅外光譜分析

傅立葉紅外光譜儀檢測預(yù)處理前后玉米秸稈。試驗條件：采用固體KBr干粉壓片，掃描范圍4 000～4 500 cm-1，掃描32次。

1.3.6 X射線衍射分析

X射線衍射儀對物料進(jìn)行分析，掃描范圍10～40°，掃描速度為4°/min，步進(jìn)掃描，步寬0.02°/s。采用衍射曲線擬合分峰計算法，表征纖維素的結(jié)晶度變化。

結(jié)晶度的計算公式[17]：

式中：CrI為結(jié)晶度；I002為結(jié)晶區(qū)的衍射角強(qiáng)度；Iam為無定形區(qū)的衍射角強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玉米秸稈預(yù)處理影響

圖1 硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玉米秸稈預(yù)處理影響Fig.1 Effect of sulfuric acid concentration on corn stover pretreatment

分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～1.5%的硫酸處理玉米秸稈，固液比1∶12.5（g∶mL），反應(yīng)溫度150℃，水解時間60 min。試驗結(jié)果（圖1）表明，硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜1.0%，預(yù)處理過程不完全，半纖維素水解率降低，硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞1.5%，玉米秸稈原料被碳化，造成物料損失。當(dāng)硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時，固體部分纖維素保留率為82.79%，半纖維素水解率為45.41%，木質(zhì)素的脫除率為54.13%，還原糖質(zhì)量濃度為1.63 g/100 mL，木糖產(chǎn)率為39.96%，此時半纖維素部分降解。木質(zhì)素的去除，解除了對纖維素的束縛作用，有利玉米秸稈后續(xù)酶水解。

2.1.2 反應(yīng)時間對玉米秸稈預(yù)處理結(jié)果影響

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的硫酸于不同時間處理玉米秸稈，固液比1∶12.5（g∶mL），反應(yīng)溫度150℃。試驗結(jié)果（圖2）表明，反應(yīng)時間為90 min時，還原糖質(zhì)量濃度為最大值。隨著反應(yīng)時間的延長，秸稈發(fā)生碳化，部分還原糖縮合成多糖，生成部分糠醛、羥甲基糠醛等副產(chǎn)物。反應(yīng)時間90 min預(yù)處理玉米秸稈，其纖維素保留率為61.18%，半纖維素水解率為32.87%，木質(zhì)素的脫除率為40.09%，還原糖質(zhì)量濃度為2.64 g/100 mL，木糖產(chǎn)率為44.39%。

圖2 反應(yīng)時間對玉米秸稈預(yù)處理影響Fig.2 Effect of reaction time on corn stover pretreatment

2.1.3 反應(yīng)溫度對玉米秸稈預(yù)處理影響

圖3 反應(yīng)溫度對玉米秸稈預(yù)處理影響Fig.3 Effect of reaction temperature on corn stover pretreatment

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%硫酸于不同溫度分別處理玉米秸稈90 min，固液比1∶12.5（g∶mL）。試驗結(jié)果（圖3）表明，隨著溫度升高，半纖維素水解率和纖維素保留率呈升高趨勢，在120℃達(dá)到最大值。繼續(xù)升高溫度，半纖維素水解率、纖維素保留率均有所下降。反應(yīng)溫度120℃時，纖維素保留率為66.06%，半纖維素水解率為63.17%，木質(zhì)素的脫除率為48.29%，還原糖質(zhì)量濃度為1.70 g/100 mL，木糖產(chǎn)率為55.59%。

2.1.4 固液比對玉米秸稈預(yù)處理影響

于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的硫酸、溫度120℃、反應(yīng)時間90 min條件下，探討不同固液比1∶16～1∶8（g∶mL）對玉米秸稈預(yù)處理影響（見圖4）。玉米秸稈預(yù)處理過程是在非均相體系中進(jìn)行，當(dāng)玉米秸稈固體比例較高時，秸稈物料顆粒與硫酸催化劑混溶時會發(fā)生溶脹及結(jié)塊，抑制催化劑對秸稈物料顆粒內(nèi)部的滲透，導(dǎo)致預(yù)處理過程不完全。若液體比例增加，水解液中還原糖質(zhì)量濃度降低。反應(yīng)體系中固液比為1∶10（g∶mL）時，纖維素保留率為78.74%，半纖維素水解率為82.39%，木質(zhì)素的脫除率39.49%，還原糖質(zhì)量濃度為2.81 g/100 mL，木糖產(chǎn)率為72.48%。

圖4 固液比對玉米秸稈預(yù)處理的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on corn stover pretreatment

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計試驗和顯著性分析

綜合單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計，硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時間（C）、固液比（D）作為響應(yīng)面設(shè)計的因素，半纖維素水解得率為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2。

利用Design-Expert軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=83.08+3.52A-1.54B+1.28C+ 0.81D-0.90AB-1.46AC-0.85AD-1.48BC-0.30BD+0.011CD-4.95A2-1.23B2-2.31C2-0.7D2用該回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=98.44%），模型的顯著水平P＜0.01，此時二次回歸方差模型是極顯著的，方程對試驗擬合較好，因此可用此模型對響應(yīng)面進(jìn)行分析和預(yù)測。通過比較方程一次項系數(shù)絕對值大小，可以判斷在本試驗工藝參數(shù)中，一次項均達(dá)到極顯著水平，交互項除BD、CD外均顯著，二次項顯著。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

利用Design-Expert軟件進(jìn)行二次多元擬合得到二次回歸方程的響應(yīng)面曲線，在兩因素條件固定不變的情況下，考察各因素交互作用對玉米秸稈半纖維素水解率的影響，所得響應(yīng)面如圖5所示。

圖5 各因素兩兩交互作用對半纖維素水解率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plot and counter line of effect of interaction between each two factors on hydrolysis rate of hemicelluloses

由圖5可知，各兩因素對玉米秸稈半纖維素水解率的影響均成拋物線形，即隨著硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、固液比的同時增大，玉米秸稈半纖維素水解率呈先增大后降低趨勢，因此預(yù)處理工藝中在一定范圍內(nèi)適當(dāng)增加各因素值可以提高半纖維素水解率。

2.2.3 響應(yīng)面因素水平優(yōu)化結(jié)果及模型驗證

對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到半纖維素水解率預(yù)測最大值時各因素水平為硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.16%，固液比1∶9（g∶mL），反應(yīng)溫度100℃，反應(yīng)時間119.91 min，預(yù)測半纖維素水解率為85.11%。為進(jìn)一步驗證模型的可靠性，考慮到實際操作情況，將最佳工藝條件修正為硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%，固液比1∶9（g∶mL），反應(yīng)溫度100℃，反應(yīng)時間120 min。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗，玉米秸稈固體部分纖維素保留率為87.89%，木質(zhì)素脫除率為46.15%，還原糖質(zhì)量濃度為2.04 g/100 mL，木糖產(chǎn)率為74.22%，玉米秸稈半纖維素水解率為84.93%，與理論預(yù)測值85.11%的偏差較小，表明Box-Behnken設(shè)計所得到的模型擬合程度高，優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3 預(yù)處理后固體部分酶水解效率分析

為驗證玉米秸稈預(yù)處理的效果，對玉米秸稈處理后所得濾渣進(jìn)行酶水解研究。酶用量25 FPU/g，酶解溫度50℃，反應(yīng)時間72 h，試驗結(jié)果（表4）表明，玉米秸稈原料酶解率為32.25%，預(yù)處理玉米秸稈固體部分酶解率為85.79%，與未處理秸稈相比酶解率提高53.54個百分點。

表4 玉米秸稈固體部分酶水解結(jié)果Table 4 Results of enzymatic hydrolysis of corn stover solid part

2.4 玉米秸稈預(yù)處理前后微觀形貌分析

未處理的玉米秸稈在電鏡下其纖維呈束狀且結(jié)構(gòu)致密，層與層之間呈現(xiàn)有序規(guī)律的排列（圖6a），經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈纖維呈現(xiàn)斷裂層剝離現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)變得疏松，比表面積增大（圖6b），預(yù)處理過程破壞了玉米秸稈內(nèi)部結(jié)構(gòu)，降低纖維素的結(jié)晶度，增加酶與底物的接觸面積，有利于提高玉米秸稈的水解效率。

2.5 玉米秸稈預(yù)處理前后紅外譜圖分析

在木質(zhì)纖維素的紅外光譜中，纖維素的特征峰為2 920 cm-1、1 425 cm-1和1 374 cm-1，β-D-葡萄糖苷的特征峰為897 cm-1的吸收峰，半纖維素的特征峰為1 736 cm-1處的吸收峰，木質(zhì)素的特征峰為1 510 cm-1和1 600 cm-1處的芳環(huán)振動吸收，1 045 cm-1、1 248 cm-1及1 270 cm-1代表C-H，O-H或-CH2鍵的伸展振動[17-18]。玉米秸稈預(yù)處理后β-D-葡萄糖苷的特征峰強(qiáng)度減小，1 045 cm-1處的吸收來自C-H彎曲振動，沒有明顯變化，1 605 cm-1和1 515 cm-1處的吸收峰是與木質(zhì)素相關(guān)吸收峰，兩峰相對吸收強(qiáng)度有變化（圖7），提示經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈物料內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖6 玉米秸稈預(yù)處理前(a)和預(yù)處理后(b)掃描電鏡圖Fig.6 Corn stover scanning electron micrograph before(a)and after(b)pretreatment

圖7 玉米秸稈預(yù)處理前(a)和預(yù)處理后(b)紅外譜圖Fig.7 Infrared spectrum of corn stover before(a)and after(b)pretreatment

2.6 玉米秸稈X射線衍射分析

圖8 玉米秸稈X射線衍射圖Fig.8 X-ray diffraction diagram of corn stover

木質(zhì)纖維素構(gòu)成的結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分?jǐn)?shù)，為纖維素聚集時形成的結(jié)晶度。由圖8可見，在22.0°、18.0°和16.0°各有一個主要峰和兩個次要峰，這3個衍射峰均發(fā)生變化。經(jīng)計算，預(yù)處理前玉米秸稈的結(jié)晶度為62.3%，預(yù)處理后玉米秸稈結(jié)晶度為49.6%，表明預(yù)處理后玉米秸稈中由于木質(zhì)素部分去除，半纖維素大部分降解，纖維素中部分結(jié)晶區(qū)變?yōu)闊o定形區(qū)，可提高后續(xù)纖維素酶的可及性，增加酶解效率。

3 結(jié)論

本研究采用Box-Behnken試驗設(shè)計方案優(yōu)化玉米秸稈預(yù)處理工藝，提高糖化酶解效率，在此條件下獲得的最佳工藝參數(shù)為硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%，固液比1∶9（g∶mL），反應(yīng)溫度100℃，時間120 min，半纖維素水解率為84.93%，木質(zhì)素脫除率為46.15%，還原糖質(zhì)量濃度為2.04 g/100 mL，木糖產(chǎn)率為74.22%，固體部分纖維素保留率87.89%，結(jié)合方差分析，建立了硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溫度、時間、固液比和半纖維素水解率之間的數(shù)學(xué)模型方程為Y=83.08+3.52A-1.54B+ 1.28C+0.81D-0.90AB-1.46AC-0.85AD-1.48BC-0.30BD+ 0.011CD-4.95A2-1.23B2-2.31C2-0.7D2。模型回歸檢驗F= 63.24，在0.01水平上差異極顯著，表明Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化玉米秸稈預(yù)處理工藝結(jié)果是可靠的，預(yù)處理固體部分酶解率85.79%，比未處理玉米秸稈酶解效率提高了53.54%，此模型的建立可為生物煉制工業(yè)過程提供科學(xué)依據(jù)。

SEM，F(xiàn)T-IR和XRD分析表明，預(yù)處理過程破壞了玉米秸稈內(nèi)部結(jié)構(gòu)，降低纖維素的結(jié)晶度，增加酶與底物的接觸面積，同時玉米秸稈中由于木質(zhì)素部分去除，半纖維素大部分降解，纖維素中部分結(jié)晶區(qū)變?yōu)闊o定形區(qū)，因而可提高后續(xù)纖維素酶的可及性，增加酶解效率。

生物質(zhì)資源比有限的石油能源更均勻地分布在地球的表面，我國為玉米主產(chǎn)區(qū)，玉米秸稈資源豐富，玉米秸稈通過預(yù)處理技術(shù)和生物轉(zhuǎn)化過程，為生產(chǎn)生物基液體燃料、平臺化學(xué)品、精細(xì)化工產(chǎn)品提供一條不依賴化石資源的新途徑和新方法，為工業(yè)應(yīng)用提供創(chuàng)新技術(shù)。

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Effect of corn stover pretreatment optimized by Box-Behnken design on enzyme sacchrification

ZHANG Shasha,FEI Zhaokui,XUE Donghua*
(College of Chemistry and Life Science,Changchun University of Technology,Changchun 130012,China)

To promote the development of bio-refinery industry and improve the efficiency of corn straw enzyme saccharification,Box-Behnken Design was applied to optimize the pretreatment process.The effect of sulphuric acid concentration,hydrolysis time,hydrolysis temperature and solid to liquid ratio on hemicellulose hydrolysis rate was optimized,and the microstructure,construction of the pretreated corn stover were analyzed by scanning electron microscope,infrared spectrometer and X-ray diffraction.Data showed that the optimal technology was determined:temperature 100℃, sulfuric acid 1.2%,time 120 min,solid-liquid ratio 1∶9(g∶ml).Under such condition,the hemicellulose hydrolysis rate was 84.93%,the lignin removal rate was 46.15%,reducing sugar content in pretreated hydrolysate was 2.04 g/100 ml,xylose yield was 74.22%,and cellulose retention in the solid was 87.89%.After 72 h enzymatic treatment,the hydrolysis rate reached 85.79%,while the untreated corn stover hydrolysis rate was 32.25%.

corn stover;H2SO4-catalyzed;enzymatic hydrolysis

TQ352.62

A

0254-5071（2014）10-0022-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.006

2014-06-25

吉林省科技發(fā)展計劃（20126035）；長春市科技支撐計劃（2012213）

張莎莎（1987-），女，碩士研究生，研究方向為生物有機(jī)化學(xué)。

*通訊作者：薛冬樺（1956-），女，教授，博士，研究方向為生物有機(jī)化學(xué)。