駱駝刺源產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌分離鑒定和菌株特性研究

應(yīng)璐，周慧杰，蔣慧

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.塔里木生物資源保護(hù)與利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300；3.塔里木大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆阿拉爾843300；4.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

駱駝刺源產(chǎn)乳酸的地衣芽孢桿菌分離鑒定和菌株特性研究

應(yīng)璐1，2，周慧杰1，蔣慧3，4*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.塔里木生物資源保護(hù)與利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300；3.塔里木大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆阿拉爾843300；4.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

為了探討產(chǎn)乳酸的芽孢桿菌對(duì)青貯發(fā)酵的作用。以青貯三個(gè)月的豆科牧草疏葉駱駝刺為材料，進(jìn)行MRS培養(yǎng)基分離、純化細(xì)菌，革蘭氏染色，芽孢染色，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特性鑒定和16S rDNA序列分析。結(jié)果顯示，菌株桿狀，G+，有芽孢，產(chǎn)乳酸；16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示該菌株與模式菌株ATCC 14580的相似性為99.3%。結(jié)果表明，該菌為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌；分離鑒定；生理生化特性；16S rDNA

青貯是將原料中的可溶性糖轉(zhuǎn)化成乳酸等酸性物質(zhì)，創(chuàng)造出的酸性環(huán)境能夠抑制有害微生物增殖，從而保存原料營(yíng)養(yǎng)成分的過(guò)程[1]。青貯飼料是復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，主要包括乳酸菌、酵母菌、梭菌、霉菌及其他腐敗細(xì)菌，其中乳酸菌是青貯發(fā)酵中起主要作用的微生物[2]。駱駝刺（Alhagi sparsifolia）是生長(zhǎng)于荒漠、半荒漠區(qū)的多年生豆科木質(zhì)化草本植物，耐干旱、耐鹽堿、抗逆性強(qiáng)[3]。豆科牧草可溶性碳水化合物含量低，附著乳酸菌數(shù)目少，蛋白質(zhì)含量高，緩沖能力強(qiáng)，pH下降緩慢，從而導(dǎo)致大量繁殖的梭菌將蛋白質(zhì)和糖分解為氨和腐臭味的丁酸，一般認(rèn)為豆科牧草不容易成功青貯[4-6]。然而，研究結(jié)果表明，無(wú)添加的高水分駱駝刺青貯容易成功，且駱駝刺和苜?；熨A還能顯著提高苜蓿青貯品質(zhì)[5]。近年來(lái)飼料中抗生素濫用被高度關(guān)注[8-9]，尋找安全高效的替代品迫在眉睫[10]。具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫高壓、耐酸堿、耐膽鹽、易貯存等生物特性的枯草芽孢桿菌[11]是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和中國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的飼用微生物[11]。新疆特殊的地理位置和地質(zhì)地貌造就了其干旱、鹽堿、極端高溫、極端低溫等多樣的生態(tài)環(huán)境，與新疆自然環(huán)境相適應(yīng)的微生物在漫長(zhǎng)的演化過(guò)程中形成了具有獨(dú)特的代謝途徑和遺傳背景的微生物類群[12]。長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化，微生物與其宿主形成了相互依賴、相互制約的統(tǒng)一整體[13]。

本研究旨在探討新疆特殊環(huán)境G+芽孢桿菌與其宿主駱駝刺青貯成功的關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行分類學(xué)鑒定，確定種屬，了解其生理生化特征，為合理開發(fā)利用駱駝刺資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

初花期疏葉駱駝刺采集于塔里木大學(xué)校園周邊，采后快速將其切割成2～3 cm，裝入500 mL試劑瓶，每瓶約700 g，細(xì)木棒層層壓實(shí)后用凡士林和透明膠帶密封，采集、切割、壓緊、填裝和密封控制在3 h以內(nèi)，青貯3個(gè)月備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

①分離純化培養(yǎng)基采用MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 6.2～6.4，121℃滅菌30 min。MRS液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

②生理生化鑒定培養(yǎng)基：碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]。

1.1.3 試劑

rTaq聚合酶、dNTP、DL2000等PCR試劑、PCR產(chǎn)物回收試劑盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）均為TaKaRa公司生產(chǎn)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RXZ-300C智能人工氣候培養(yǎng)箱：江蘇寧波東南儀器有限公司；DHG-9140電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FHZ-82A氣浴恒溫振蕩器：金壇市醫(yī)療器械廠；FHZ-82A超凈工作臺(tái)：上海BoXun有限公司；FA-JA2004 N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；CX31生物顯微鏡：日本OLYMPUS；BCD-226SD冰箱：青島海爾股份有限公司；732可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；DYY-6D電泳儀：北京六一儀器廠；MiniSpin Plus高速冷凍離心機(jī)、Research plus：德國(guó)Eppendorf公司；GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)、iCycler PCR儀：美國(guó)BIO-RAD公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管：杭州天河微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 地衣芽孢桿菌的分離純化

將切碎的樣品用滅菌水做10倍梯度的稀釋，充分振蕩使其混勻，將混勻后的材料進(jìn)行倍比稀釋，選取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度，菌懸液500 μL涂布于MRS培養(yǎng)基固體平板上，每個(gè)梯度稀釋液涂布3個(gè)平板，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行革蘭氏染色觀察和芽胞染色觀察，陽(yáng)性單菌落分離純化后MRS液體培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)24 h，25%滅菌甘油-18℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 地衣芽孢桿菌16S rDNA序列分析

取1 mL活化菌懸液，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，收集菌細(xì)胞作為PCR擴(kuò)增模板，16S rDNA通用引物[16]，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系（25μL）：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2.5 mmol/L 2.0 μL上下游引物2.5 mmol/L各0.5 μL，rTaq（5 U/μL）酶0.3 μL，模板1 μL，重蒸水18.2 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min。16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用TaKaRa公司PCR回收試劑盒，按說(shuō)明書回收、純化目的片段。經(jīng)純度檢測(cè)后，委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中的進(jìn)行BLAST同源比對(duì)，初步鑒定細(xì)菌種類。使用DNA Star軟件以Lipman Method分析此菌株與模式菌株16S rDNA的相似性。

1.3.3 地衣芽孢桿菌的生理生化特性鑒定

在地衣芽孢桿菌16S rDNA序列分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)方法參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]，產(chǎn)乳酸實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)等采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管鑒定，耐鹽實(shí)驗(yàn)、耐酸實(shí)驗(yàn)、溫度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)參照[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落和細(xì)胞形態(tài)特征

從青貯3個(gè)月的疏葉駱駝刺中分離得到5株革蘭氏陽(yáng)性菌，分別命名為H1、H2、H3、H4和H5。菌體桿狀，長(zhǎng)1.5～3.0 μm，寬0.6～0.8 μm，內(nèi)有明顯芽孢，見圖1；菌落不透明白色，表面平滑而干燥，邊緣整齊。

圖1 分離菌株顯微照片(1 000×)Fig.1 Photomicrographs of isolated strain(1 000×)

2.2 16S rDNA序列分析

16S rDNA分析方法已經(jīng)被用于芽孢桿菌的鑒定[18]，將分離純化得到的菌株H1進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，序列全長(zhǎng)1 516 bp，結(jié)果見圖2。該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，初步確定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。采用DNAStar軟件分析該序列與地衣芽孢桿菌的模式菌株ATCC 14580（NCBI登錄號(hào)：NR_074923）16S rDNA基因序列相似性99.3%。

2.3 生理生化特征

根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果對(duì)菌株H1進(jìn)行了生理生化鑒定，結(jié)果見表1、表2。

圖2 菌株H1 16S rDNA序列測(cè)序結(jié)果Fig.2 16S rDNA sequence of strain H1

由表1可知，菌株H1可以同化碳源α-D-葡萄糖、纖維二糖、D-蜜二糖、D-半乳糖、蔗糖、D-海藻糖、乳糖、果糖、D-棉子糖、甘露糖、D-甘露醇、D-木糖、丙三醇、山梨醇和麥芽糖，不能同化碳源龍膽二糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、D-松三糖、木糖醇和松二糖；可以同化氮源（NH4）2SO4和KNO3。

表1 碳源、氮源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of carbon and nitrogen assimilation tests

由表2可知，菌株H1能夠產(chǎn)乳酸、液化明膠、水解淀粉和接觸酶陽(yáng)性；15～55℃均能生長(zhǎng)，65℃停止生長(zhǎng)；弱酸性到中性條件下（pH 4～7）均能生長(zhǎng)，強(qiáng)酸性條件下（pH≤3）停止生長(zhǎng)；2%～10%NaCl正常生長(zhǎng)，12%NaCl停止生長(zhǎng)。

表2 菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of strain physiological and biochemical tests

3 結(jié)論

駱駝刺青貯中分離得到一株革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，經(jīng)菌落形態(tài)特征鑒定、生理生化特征鑒定及16S rDNA序列分析，鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

[1]張慧杰，玉柱，王林，等.孫啟忠青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選[J].草地學(xué)報(bào)，2011，19（1）：137-141.

[2]張秀芬.飼草飼料加工與貯藏[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[3]曾凡江，張希明，李小明.駱駝刺植被及其資源保護(hù)與開發(fā)的意義[J].干旱區(qū)地理，2002，25（3）：286-288.

[4]張金霞，喬紅霞，劉雨田.水分和添加劑對(duì)紫花苜蓿青貯品質(zhì)的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2014，31（4）：766-770.

[5]許慶方.影響苜蓿青貯品質(zhì)的主要因素及苜蓿青貯在奶牛日糧中應(yīng)用效果的研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2005.

[6]劉春龍，李忠秋，孫海霞，等.影響青貯飼料品質(zhì)的因素[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2006，32（5）：63-66.

[7]JIANG H,JIANG Q S,YING L.Effect of different maturity on Alhagi sparsifolia Shap silage quality[C].International Conference on Computer Distributed Control and Intelligent Environmental Monitoring(CDCIEM),Changsha,China,2011.

[8]程錦泉，劉少礎(chǔ).超級(jí)細(xì)菌的警示與濫用抗生素潛在公共衛(wèi)生問(wèn)題[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2010，26（12）：1521-1522.

[9]馮晶晶，王小萬(wàn)，靖瑞鋒.控制抗生素濫用的國(guó)際經(jīng)驗(yàn)及啟示[J].中國(guó)抗生素雜志，2014，39（1）：14-18.

[10]李燕榮，蘭鄒然，姜平.新型抗生素替代品研究進(jìn)展[J].當(dāng)代畜牧，2014（3）：54-56.

[11]趙述淼.豬源益生芽孢桿菌的分離篩選與應(yīng)用研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2009.

[12]唐永紅，曹庸，盧成瑛，等.特殊生境微生物及其活性代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào)，2006，33（4）：163-166.

[13]JENSEN M S,JENSEN S K,JAKOBSEN K.Development of digestive enzymes in pigs with emphasison lipolytic activity in the stomach and pancreas[J].J Anim Sci,1997,75(2):437-445.

[14]布坎南R.E，吉本斯N.E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].第8版.北京：科學(xué)出版社，1984.

[15]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[16]TOJU H,TANABE A S,YAMAMOTO S,et al.High-coverage ITSprimers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental sample[J].PloS One,2012,7(7):1-11.

[17]范志平，王修俊，程艷波，等.泡菜中優(yōu)良乳酸菌的篩選鑒定及生長(zhǎng)特性的研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2014，39（3）：10-14，26.

[18]朱薇玲，張?zhí)O，李金華.芽孢桿菌B15的分子生物學(xué)鑒定及高產(chǎn)蛋白酶菌株選育[J].中國(guó)釀造，2013，32（7）：65-67，93.

Isolation,identification and characterization of Bacillus licheniformis from Alhagi sparsifolia Shap.

YING Lu1,2,ZHOU Huijie1,JIANG Hui3,4*
(1.College of Life Science,Tarim University,Alaer 843300,China;2.Xinjiang Production&Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin,Tarim University,Alaer 843300,China;3.College of Animal Science,Tarim University,Alaer 832003,China;4.Xinjiang Production&Construction Corps Key Laboratory of Animal Husbandry Science and Technology in Tarim,Alaer 843300,China)

In order to explore the effect of lactic acid-producing Bacillus on silage fermentation,using Alhagi sparsifolia Shap.ensiled for three months as materials,Bacillus was isolated and purified with MRS medium.And then the isolate strains were identified with Gram staining,spore staining,cell colony morphology observation,physiological and biochemical characteristics identification and 16S rDNA sequencing analysis were used to identify.Result showed that the bacterium were rod-shaped,Gram-positive,spore-forming,and lactic acid-producing.The 16S rDNA result showed that the similarity between the strain and the published sequence(type strain ATCC 14580)was 99.3%.To sum up,the strain was identified as Bacillus licheniformis.

Bacillus licheniformis;identification;physiological and biochemical characteristics;16S rDNA

Q93-331

A

0254-5071（2014）10-0014-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.004

2014-07-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（30960259，31260562）；大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（20131075003）

應(yīng)璐（1978-），女，講師，碩士，研究方向微生物生物化學(xué)。

*通訊作者：蔣慧（1969-），女，教授，碩士，研究方向動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)及飼料。