轉(zhuǎn)Bt基因早熟春甘藍抗蟲材料的獲得

王 麗 儀登霞 楊麗梅* 劉建萍 方智遠 程 斐 劉玉梅 莊 木 張揚勇 孫培田

（1 青島農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山東青島 266109；2 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

結(jié)球甘藍（Brassica oleraceaL.var.capitataL.）是我國重要的蔬菜作物，在蔬菜周年供應(yīng)及出口貿(mào)易中占有重要的地位，種植面積逐年擴大，已達到每年約90萬hm2（方智遠，2008；楊麗梅 等，2011）。近年來，甘藍蟲害日趨嚴重，以鱗翅目的小菜蛾（Plutella xylostella）和菜青蟲（Pieris rapae）等為害最為嚴重。尤其是小菜蛾，由于其適應(yīng)性強、繁殖速度快、世代交替嚴重、易產(chǎn)生抗藥性，已成為甘藍上最難防治的害蟲之一。目前生產(chǎn)上害蟲的防治以施用化學藥劑為主，但化學農(nóng)藥污染環(huán)境、危害人畜健康，且一些害蟲已對多種化學殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性。因此，培育抗蟲品種是防治害蟲最理想的方法。利用植物基因工程技術(shù)將外源抗蟲基因?qū)敫仕{，可為甘藍育種提供有效的抗蟲種質(zhì)資源。

Holbrook 和Miki（1985）首先對甘藍進行了遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得再生植株；其后許多研究者致力于甘藍的抗蟲轉(zhuǎn)基因研究，并取得了顯著成績（Metz et al.，1995；毛慧珠 等，1996；Jin et al.，2000；李漢霞 等，2006；李賢 等，2008；崔磊 等，2009；Rafat et al.，2010；Yi et al.，2011，2013）。其中研究和應(yīng)用較多的抗蟲基因是Btcry1類基因。cry1Ia8基因是經(jīng)密碼子優(yōu)化人工合成新序列的cry1類基因，其表達的毒蛋白對小菜蛾等害蟲具有高毒力，且與Cry1A類蛋白沒有交互抗性（Escudero et al.，2006；竇黎明 等，2007）。

由于春甘藍生長后期和秋甘藍苗期處于高溫階段，更有利于小菜蛾的生長發(fā)育，因此小菜蛾的發(fā)生和為害最嚴重。中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甘藍青花菜課題組之前已獲得中晚熟扁球型秋甘藍Bt 抗蟲轉(zhuǎn)基因株系（崔磊 等，2009），但尚缺乏早熟春甘藍抗蟲材料。另外，前人進行遺傳轉(zhuǎn)化研究所用的甘藍材料多為雜交種，限制了其利用。本試驗將cry1Ia8基因轉(zhuǎn)入早熟春甘藍高代自交系F2011 中，獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因植株，進一步豐富甘藍抗蟲種質(zhì)資源，為甘藍抗蟲育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試驗于2012年5月至2014年3月在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甘藍青花菜實驗室進行。遺傳轉(zhuǎn)化材料為早熟圓球型春甘藍高代自交系F2011，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所甘藍青花菜課題組提供。

1.1.2 抗蟲基因 遺傳轉(zhuǎn)化所用抗蟲基因為Btcry1Ia8基因，由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.1.3 菌株和載體 供試根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105，質(zhì)粒載體為pCSIaN（13 kb），含有卡那霉素抗性基因，由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所提供。1.1.4 供試昆蟲 生物測定所使用的小菜蛾為敏感小菜蛾種群和對Cry1Ac 有抗性的小菜蛾種群，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所昆蟲組提供。

1.2 轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基

MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，固體YEP 培養(yǎng)基（10 g·L-1酵母提取物+10 g·L-1胰蛋白胨+5 g·L-1NaCl）為培養(yǎng)農(nóng)桿菌所用培養(yǎng)基，液體MS 培養(yǎng)基為菌液懸浮培養(yǎng)基。甘藍遺傳轉(zhuǎn)化各階段所用培養(yǎng)基如表1所示。

表1 甘藍遺傳轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基

1.3 試驗方法

1.3.1 結(jié)球甘藍的遺傳轉(zhuǎn)化 外植體準備：甘藍種子經(jīng)70%酒精滅菌1～2 min，14%次氯酸鈉溶液滅菌10 min，無菌水沖洗3～4次后，接種到MS 固體培養(yǎng)基上，25℃、16 h/8 h（晝/夜，下同）光周期條件下進行培養(yǎng)。5 d后，切取無菌苗的下胚軸和具柄子葉作為外植體，接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃、16 h/8 h 光周期條件下預(yù)培養(yǎng)2 d。

菌液制備：取劃線培養(yǎng)的農(nóng)桿菌單菌落，接種到含100 mg·L-1卡那霉素（Kan）和50 mg·L-1利福平的YEP 液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r·min-1條件下振蕩過夜。取搖好的菌液（OD600=0.6～0.8），于3 000 r·min-1、4℃條件下離心10 min，收集細菌，用液體MS 培養(yǎng)基懸浮。

遺傳轉(zhuǎn)化：取預(yù)培養(yǎng)2 d 的下胚軸和具柄子葉，用懸浮好的菌液分別侵染8、15 min。接種到置有一層無菌濾紙的再生培養(yǎng)基上，（25±1）℃條件下暗培養(yǎng)3 d。清洗外植體，接種到延遲培養(yǎng)基上，25℃、16 h/8 h 光周期條件下進行培養(yǎng)。7 d后，將外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，經(jīng)卡那霉素篩選至抗性芽長1 cm 左右，將保持綠色的抗性芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中長成完整植株。煉苗1～2 d，移入營養(yǎng)缽，置于溫室內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2 分子檢測 PCR 檢測：用CTAB法（Murry & Thomas，1980）分別提取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株（未經(jīng)侵染的植株，CK）的總DNA，并以其為模板進行PCR 擴增。根據(jù)cry1Ia8基因序列設(shè)計引物，預(yù)擴增片段大小為769 bp，上游引物序列為5′-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3′，下游引物序列為5′-ACTTGGATGCGGATGGAC-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR 擴增體系：基因組DNA 4 μL，10×buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，cry1Ia8-F 0.8 μL，cry1Ia8-R 0.8 μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O 10.4 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性60 s，58℃退火 60 s，72℃延伸 90 s，30次循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

Southern blot 檢測：取PCR 檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株DNA 15 μg，經(jīng)Fast Digest 快速限制性內(nèi)切酶（購自賽默飛世爾科技公司）37℃酶切10 min，于1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，然后置于20×SSC溶液中過夜轉(zhuǎn)膜，120℃條件下固定30 min；同時將目的基因質(zhì)粒DNA 進行PCR 擴增，地高辛試劑盒（Roche 公司）標記其擴增產(chǎn)物作探針，過夜雜交，對雜交后的尼龍膜進行洗膜、顯色、定影。

RT-PCR檢測：取Southern blot檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，進行PCR 擴增。cry1Ia8擴增引物序 列為cry1Ia8-F：5′-CAAAGCACTTACCGACCTC-3′；cry1Ia8-R：5′-CATTGACAGGGTGAGTGAGGA-3′，預(yù)擴增片段大小為893 bp； 以β-actin作為內(nèi)參，擴增引物序列為β-actin-F：5′-ATCTGGCATCACACTTTCTAC-3′；β-actin-R：5′-ATCTCTTTGCTCATACGGTCT-3′，預(yù)擴增片段大小為697 bp。RT-PCR 擴增程序同PCR 擴增程序。

Western blot 檢測：用Tris 緩沖液分別提取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株可溶性總蛋白。首先用SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，然后轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，BSA 過夜封閉，加入一抗（Bt 毒蛋白的抗血清，工作濃度為1∶5 000，由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供），洗膜；加入二抗（堿性磷酸酯酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG，工作濃度為1∶20 000，購于Sigma 公司），洗膜；最后用含NBT/BCIP 的顯色液顯色至出現(xiàn)目的條帶。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因植株飼蟲試驗 采用室內(nèi)離體葉片飼喂法，取苗期轉(zhuǎn)基因植株及非轉(zhuǎn)基因植株上部相同部位的幼嫩葉片，用打孔器打成直徑為6 cm 的圓片，分別置于內(nèi)置1 張濕潤濾紙的直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿接種小菜蛾2 齡幼蟲10 頭，3次重復(fù)。置于（25±1）℃、16 h/8 h 光周期條件下培養(yǎng)，6 d后觀察記錄葉片受損傷程度，調(diào)查死蟲數(shù)和活蟲數(shù)，并計算小菜蛾幼蟲的校正死亡率。

葉片受損分級標準（王欣 等，2007）：0級，葉片無咬食；1級，蟲食面積在1/4 以內(nèi)；3級，蟲食面積1/4～1/2；5級，蟲食面積1/2～3/4；7級，蟲食面積在3/4以上。

1.3.4 轉(zhuǎn)基因植株Bt 毒蛋白含量測定 取轉(zhuǎn)基因植株葉片1 g，提取總蛋白。用磷酸緩沖液包被目的蛋白，4℃過夜；洗板，加入封閉液，37℃封閉1 h；洗板，加入一抗，37℃孵育1 h；洗板，加入二抗，37℃孵育1 h；避光加顯色液，顯色10～30 min；加終止液50 μL，在酶聯(lián)檢測儀490 nm 波長下測定OD值，計算Bt 毒蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

甘藍遺傳轉(zhuǎn)化的各個階段如圖1所示，外植體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基1個月后，部分外植體分化出愈傷組織，并長出再生芽；將綠色的再生芽切下，接種到生根培養(yǎng)基中，共獲得37株卡那霉素抗性 植株。

圖1 甘藍遺傳轉(zhuǎn)化的不同階段

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測

以轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA 為模板，以cry1Ia8質(zhì)粒DNA 為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因植株DNA 為陰性對照進行PCR 檢測，共有23株轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為陽性，部分結(jié)果如圖2所示。其中，3、5、6、7、9 道的樣本擴增出了大小為769 bp 的目的條帶，4、8、10 道的樣本沒有相應(yīng)條帶產(chǎn)生。

圖2 部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot 檢測

選取7株P(guān)CR 檢測為陽性的甘藍轉(zhuǎn)基因植株，提取基因組總DNA。用地高辛試劑盒標記探針，進行Southern blot 檢測分析，結(jié)果顯示TF1、TF3、TF5、TF7植株均出現(xiàn)雜交信號（圖3），證明外源基因cry1Ia8已整合到甘藍基因組中。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot 檢測結(jié)果

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR 檢測

提取Southern blot 檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，以β-actin作內(nèi)參對照，進行RT-PCR 檢測。結(jié)果顯示（圖4），陰性對照和轉(zhuǎn)基因植株樣品中均有β-actin內(nèi)參條帶產(chǎn)生，轉(zhuǎn)基因植株TF1、TF3、TF5與陽性對照均產(chǎn)生了大小為893 bp 的目的條帶，但TF7未產(chǎn)生大小為893 bp 的目的條帶，可能是由于外源基因發(fā)生了基因沉默。RT-PCR 檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的cry1Ia8基因在RNA 水平上得到了表達。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR 檢測結(jié)果

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的Western blot 檢測

提取Southern blot 和RT-PCR 檢測均為陽性的轉(zhuǎn)基因植株的可溶性蛋白，以cry1Ia8表達蛋白（分子量約81 kD）為陽性對照，進行Western blot 檢 測。結(jié)果顯示（圖5），轉(zhuǎn)基因植株TF1、TF3、TF5在約81 kD處均有雜交條帶產(chǎn)生，而非轉(zhuǎn)基因植株則無此條帶。Western blot 檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的cry1Ia8基因在蛋白質(zhì)水平上得到了表達。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株的Western blot 檢測結(jié)果

2.6 轉(zhuǎn)基因植株飼蟲試驗

取3株轉(zhuǎn)基因植株葉片，分別接種敏感小菜蛾和Cry1Ac 抗性小菜蛾的2 齡幼蟲，鑒定轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲效果。小菜蛾取食轉(zhuǎn)基因植株葉片2 d后，身體開始逐漸僵硬，6 d 內(nèi)陸續(xù)死亡（圖6）；而對照植株被取食嚴重，植株上的小菜蛾生長發(fā)育正常?？瓜x性鑒定結(jié)果表明（表2），轉(zhuǎn)基因植株對敏感小菜蛾和抗性小菜蛾均具有較好的抗性。

圖6 轉(zhuǎn)基因植株離體飼蟲試驗結(jié)果

表2 轉(zhuǎn)基因植株飼蟲試驗結(jié)果

圖7 轉(zhuǎn)基因植株葉片Bt 毒蛋白的ELISA 檢測結(jié)果

2.7 轉(zhuǎn)基因植株Bt 蛋白含量測定

采用ELISA 法檢測cry1Ia8基因在各轉(zhuǎn)基因植株中的蛋白表達量，結(jié)果如圖7所示，TF1、TF3、TF5的Bt 蛋白表達量分別為241.8、210.5、201.9 ng·g-1（FW）。

3 結(jié)論與討論

本試驗利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Btcry1Ia8基因?qū)朐缡靾A球型春甘藍高代自交系中，并進行了DNA、RNA 和蛋白質(zhì)水平上的分子檢測，證明外源Bt基因已經(jīng)整合到甘藍基因組中并得到表達。但是部分轉(zhuǎn)化植株在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上并沒有表達，可能是由于外源基因整合后的基因沉默導(dǎo)致的。造成基因沉默的原因主要有密碼子的偏愛性、DNA 甲基化作用、存在基因同源序列及轉(zhuǎn)錄后水平的沉默等（Meyer，1998；Matzke et al.，2000），因此在甘藍轉(zhuǎn)基因中應(yīng)采取有效避免基因沉默的方法，如選用植物偏愛的密碼子、改造和修飾基因、使用增強子和啟動子等，以提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的高效表達。

獲得的cry1Ia8基因轉(zhuǎn)基因植株離體飼蟲試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株對敏感小菜蛾和Cry1Ac 抗性小菜蛾均具有較好的抗性，但抗蟲性強弱存在差異，可能與目的基因整合位點的隨機性和整合后的基因修飾導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株毒蛋白表達量不同有關(guān)（Matzke et al.，1994；Cao et al.，1999）。因此本試驗又采用ELISA 法測定了轉(zhuǎn)基因植株的Bt 毒蛋白表達量，結(jié)果表明Bt 毒蛋白表達量高的植株其抗性也較強，反之則抗蟲性較弱。

近年來，隨著植物基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，國內(nèi)外許多研究者已利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功獲得多種作物的轉(zhuǎn)基因植株，為作物品種改良提供了新的機遇。但大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物還處于基礎(chǔ)研究階段，對于外源基因在受體植物中的遺傳穩(wěn)定性的研究還不多。外源基因能否在受體植物中穩(wěn)定遺傳和表達是基因工程育種成敗的關(guān)鍵。由于外源基因整合的方式不同，或者由于外源基因的丟失、重組和沉默等因素的影響，有些轉(zhuǎn)基因作物農(nóng)藝性狀表現(xiàn)不佳、外源基因呈現(xiàn)不規(guī)則的遺傳或蛋白表達量較低（Tu et al.，2000），給轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用造成困難。因而，有待于進一步研究cry1Ia8基因在轉(zhuǎn)基因甘藍后代中的遺傳穩(wěn)定性，加速轉(zhuǎn)基因甘藍在實踐中的應(yīng)用。

崔磊，楊麗梅，劉楠，郎志宏，劉玉梅，莊木，張揚勇，張友軍，黃大昉，方智遠.2009.Btcry1Ia8抗蟲基因?qū)Y(jié)球甘藍的轉(zhuǎn)化及其表達.園藝學報，36（8）：1161-1168.

竇黎明，韓嵐嵐，張杰，何康來，趙奎軍，黃大昉，宋福平.2007.蘇云金芽胞桿菌cry1Ia基因的克隆、表達與活性研究.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，15（6）：1053-1057.

方智遠.2008.我國甘藍產(chǎn)銷變化與育種對策.中國蔬菜，（1）：1-2.

李漢霞，尹若賀，陸芽春，張俊紅.2006.Cry1A（c）轉(zhuǎn)基因結(jié)球甘藍的抗蟲性研究.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，14（4）：546-550.

李賢，姚泉洪，彭日荷，熊愛生，薛永，金曉芬.2008.Bt 轉(zhuǎn)基因抗蟲甘藍的研制.上海農(nóng)業(yè)學報，24（3）：16-20.

毛慧珠，唐惕，曹湘嶺，白永延.1996.抗蟲轉(zhuǎn)基因甘藍及其后代的研究.中國科學：C 輯，26（4）：339-347.

王欣，李錫香，吳青君，徐寶云，張友軍.2007.白菜抗小菜蛾網(wǎng)室鑒定和離體鑒定方法比較.中國蔬菜，（12）：12-24.

楊麗梅，方智遠，劉玉梅，莊木，張揚勇，孫培田.2011.“十一五”我國甘藍遺傳育種研究進展.中國蔬菜，（2）：1-10.

Cao J，Tang J D，Strizhov N，Shelton A M，Earle E D.1999.Transgenic broccoli with high levels ofBacillus thuringiensisCry1C protein control diamondback moth larvae resistant to Cry1A or Cry1C.Mol Breed，2（5）：131-141.

Escudero I R，Estela A，Porcar M，Martinez C，Oguiza J A，Escriche B，F(xiàn)erre J，Caballero I P.2006.Molecular and insecticidal characterization of a Cry1I protein toxic to insects of the families Noctuidae，Tortricidae，Plutellidae and Chrysomelidae.Applied and Environmental Microbiology，72（7）：4796-4804.

Holbrook L A，Miki B L.1985.Brassica grown gall tumourigenesis and in vitro of transformed tissue.Plant Cell Reports，4：329-332.

Jin R G，Liu Y B，Tabashinik B E，Borthakur D.2000.Development of transgenic cabbage（Brassica oleraceavar.capitata）for insect resistance byAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation.In Vitro Cellular & Developmental Biology-plant，36：231-237.

Matzke A J M，Neuhiber F，Park Y D，Ambros P F，Matzke M A.1994.Homology dependent gene silencing in transgenic plants：epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes.Molecular and General Genetics，244：219-229.

Matzke M A，Metre M E，Matzke A J M.2000.Transgene silencing by the host genome defense：implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates.Plant Mol Bio，43：401-415.

Meyer P.1998.Stabilities and instabilities in transgene expression//Lindsey K.Trangenic plant research.Zurich：Harwood Academic：263-275.

Metz T D，Dixit R，Earle E D.1995.Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of broccoli（Brassica oleraceavar.italica）and cabbage（Brassica oleraceavar.capitata）.Plant Cell Reports，15：287-292.

Murry M，Thomas W F.1980.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Necleic Acid Res，8：4321-4325.

Rafat A，Aziz M A，Rashid A A，Abdullah S N A，Kamaladini H，Sirchi M H T，Javadi M B.2010.Optimization ofAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation and shoot regeneration after cocultivation of cabbage（Brassica oleraceassp.capitata）cv.KY Cross withAtHSP101gene.Scientia Horticulturae，124：1-8.

Tu J，Zhang G，Datta K，Xu C，He Y，Zhang Q，Khush G S，Datta S K.2000.Field performance of transgenic elite commercial hybrid rice expressingBacillus thuringiensisδ-endotoxin.Nature Biotechnology，18：1101-1104.

Yi D X，Cui L，Liu Y M，Zhuang M，Zhang Y Y，F(xiàn)ang Z Y，Yang L M.2011.Transformation of cabbage（Brassica oleraceaL.var.capitata）with Btcry1Ba3gene for control of diamondback moth.Agricultural Sciences in China，10（11）：1693-1700.

Yi D X，Cui L，Wang L，Liu Y M，Zhuang M，Zhang Y Y，Zhang J，Lang Z H，Zhang Z X，F(xiàn)ang Z Y，Yang L M.2013.Pyramiding of Btcry1Ia8andcry1Ba3genes into cabbage（Brassica oleraceaL.var.capitataL.）confers effective control against diamondback moth.Plant Cell Tiss Organ Cult，115：419-428.