實(shí)時(shí)熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

周雪花

云南省文山州疾病預(yù)防控制中心，云南文山663000

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測(cè)中的應(yīng)用

周雪花

云南省文山州疾病預(yù)防控制中心，云南文山663000

目的探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測(cè)中的應(yīng)用效果。方法選取2009年9月—2013年12月在我州采集的流感樣病例咽拭子2489件進(jìn)行分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)流感病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，觀察檢測(cè)陽(yáng)性率和陽(yáng)性樣本的類型，以分析流感的流行趨勢(shì)。結(jié)果2009年9月—2013年12月共檢出流感病毒核酸陽(yáng)性676件，檢測(cè)陽(yáng)性率為27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季節(jié)性甲3亞型病毒126件，占7.54%；季節(jié)性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。每年6～9月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢(shì)，在10～11月達(dá)到高峰期；6～9月以季節(jié)性甲3亞型病毒為主要流行病株，10～11月甲型H1N1病毒成為主要流行病株。結(jié)論實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種科學(xué)有效的檢測(cè)方法，可對(duì)流感病毒核酸進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，分析流感病毒的流行規(guī)律，有效預(yù)防突發(fā)公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；流感；病毒核酸；檢測(cè)；應(yīng)用

2009年3月份在墨西哥爆發(fā)甲型H1N1流感，并且迅速蔓延至全球，使人們意識(shí)到預(yù)防流感的重要性[1-2]。為了探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測(cè)中的應(yīng)用效果，本文選取2009年9月—2013年12月在我市某地區(qū)采集的流感樣病例咽拭子2489件作為研究對(duì)象進(jìn)行分析，結(jié)果匯報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

資料來(lái)源于2009年9月—2013年12月在我州采集的流感樣病例咽拭子2489件。

1.2 方法

1.2.1 采集2489件咽拭子是擦拭雙側(cè)咽扁桃體和咽后壁，剪去一部分放置在無(wú)菌病毒采樣液中，以4℃的條件下保存，盡快送至實(shí)驗(yàn)室，其中疑似甲型H1N1病毒的病例采用A類包裝。

1.2.2 試劑和儀器采用STRATAGENE MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。試劑盒采用QIAGEN公司的RneasyMiniKit(Catalog#74104)病毒核酸提取試劑盒，及其配套的試劑，其陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果對(duì)比參照試劑盒配套說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 檢測(cè)方法RT-PCR快速檢測(cè)試驗(yàn)步驟

（1）流感病毒核酸提取—QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit(Catalog#74104)：①取一支無(wú)菌、無(wú)酶的1.5ml Eppendorf管，加入500ul RLT。②取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）100uL，加入上述Eppendorf管中。③加5uL β-巰基乙醇，充分混勻。④加600uL 70%乙醇，于旋轉(zhuǎn)混合器混勻。⑤從試劑盒中取出帶濾膜的離心柱，并標(biāo)上標(biāo)本號(hào)。⑥將第4步的混合液分兩次（每次600uL）吸入于濾柱中，12000rpm離心15 s，棄收集管中的離心液。⑦濾柱仍放回收集管上，將第4步的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm離心15 s，棄收集管中液體。⑧于濾柱中加入700uLRW1，12000rpm離心15 s。⑨從試劑盒中取出一支新的2 mL收集管，將離心后的濾柱轉(zhuǎn)到新的收集管上，于柱子中加入500ulRPE，12000rpm離心15 s棄收集管中液體。⑩濾柱放回收集管上，于濾柱中加入500uL RPE，13000～14000rpm離心2 min。11從試劑盒中取出一支1.5mL Eppendorf管，將濾柱轉(zhuǎn)到新的1.5mL管上，于濾柱中加入30～50uL無(wú)RNA酶的水，室溫靜置1～3 min。1212000rpm離心1 min，棄濾柱。收集的離心液即為提取病毒的RNA，可以直接用于逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，或在-20℃以下保存，-30℃可保存3～4個(gè)月。

注意事項(xiàng)：①試劑盒中的RPE液用前需加44 mL無(wú)水乙醇，使終體積達(dá)到55 mL；②所有用過(guò)的槍頭、收集管放入2%次氯酸鈉消毒缸中過(guò)夜；③每步均需要更換槍頭。

（2）在潔凈緩沖間、二級(jí)生物安全柜配制RT—PCR(real time PCR)反應(yīng)液。（以下均存-20℃）：

①一對(duì)特異引物和寡核苷酸探針（季節(jié)性FLuA、FLuB、H1、H3、H5、H7、H9等）。

手掌型離心機(jī)離心15～20 s后（防止突然開(kāi)蓋引物和探針飄走），按各自標(biāo)注的OD值加入無(wú)酶水，混勻，離心即為儲(chǔ)備液。依據(jù)說(shuō)明書(shū)，各相應(yīng)的一對(duì)特異引物（F、R）按2.5倍稀釋、寡核苷酸探針（P）按5倍（有的為10倍稀釋）即為使用液

②各季節(jié)性流感反應(yīng)體系（按n+2用量配制）及其反應(yīng)條件(需根據(jù)引物調(diào)整)。

RT-PCR Master Mix12.5uL60℃5min/50℃30min/95℃15min(1個(gè)循環(huán))

RT-Mix0.25uL95℃15s/55℃30s/(收集熒光)/72℃30 s

DH2O5.75uL（45個(gè)循環(huán)）

F(5′上游引物使用液)0.5uL72℃5 min（1個(gè)循環(huán)）

R(3′下游引物使用液)0.5uL

P（寡核苷酸探針使用液）0.5uL

③新甲型H1N1(豬甲流-2009)—北京金豪試劑反應(yīng)體系（按n+ 2用量配制）及其反應(yīng)條件。

H1N1各反應(yīng)液2000 rpm離心10 s50℃30min/95℃3 min（1個(gè)循環(huán)）

（FLuA、SWH1、SWF FLuA、RNP內(nèi)標(biāo)）各20 uL95℃15s/50℃30s/72℃1 min

各反應(yīng)液分別加逆轉(zhuǎn)錄酶0.35 uL（5個(gè)循環(huán)）

DNA聚合酶1 uL

（混勻離心）95℃10s/55℃40s(收集熒光)（45個(gè)循環(huán)）

于提取間，反應(yīng)體系20 uL+模板RNA提取液5 uL。進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。陽(yáng)性：Ct值＜35.0，并且呈現(xiàn)S形曲線,陰性：Ct值為0。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，用（±s）表示，P＜0.05說(shuō)明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性率

2009年9月—2013年12月的2489件流感樣病例咽拭子中，共檢出流感病毒核酸陽(yáng)性676件，陽(yáng)性檢出率為27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季節(jié)性甲3亞型病毒126件，占7.54%；季節(jié)性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性率

2.2 流感病毒流行特征

每年6～9月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢(shì)，在10月～次年3月達(dá)到高峰期；6～9月以季節(jié)性甲3亞型病毒為主要流行病株，10月～次年3月甲型H1N1病毒成為主要流行病株。

3 討論

流感之一種急性呼吸系統(tǒng)疾病，主要由流感病毒引起，臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱、酸痛、乏力、呼吸道癥狀等。流感傳染性強(qiáng)、潛伏期短、傳播迅速，可分為甲、乙、丙三種類型，其中以甲型流感對(duì)人們的威脅最大[3-4]，因而必須加強(qiáng)對(duì)流感的檢測(cè)和防控。

流感病毒致病能力較強(qiáng)，而且容易發(fā)生變異，而且人們對(duì)特異性菌株缺乏必要的免疫力，因而會(huì)導(dǎo)致流行暴發(fā)。相關(guān)研究表明，一場(chǎng)大型流感會(huì)導(dǎo)致整個(gè)地區(qū)的壽命降低[5]，因而必須加強(qiáng)流感的防控，為此我市疾病防控中心采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)流感病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，取得了良好的效果。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，相比于普通的RT-PCR檢測(cè)來(lái)說(shuō)，其實(shí)驗(yàn)周期更短，靈敏度更低，而且不容易造成實(shí)驗(yàn)室污染[6]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)能夠利用PCR對(duì)DNA的高效擴(kuò)增、光譜技術(shù)的敏感性和探針技術(shù)的特異性，敏感性較高，重復(fù)性好，而且更為直觀，操作簡(jiǎn)單，容易操作，采用閉管檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的污染能夠降到最低，因而具有良好的實(shí)用性；采用磁珠法進(jìn)行提取核酸，能夠最大限度的結(jié)合核酸，而且清洗效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化提取，操作方便[7-8]。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，2009年9月—2013年12月共檢出流感病毒核酸陽(yáng)性676件，檢測(cè)陽(yáng)性率為27.16%；其中甲型H1N1病毒最多，各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，每年9月～次年的3月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢(shì)。這充分證明了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。

但是在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中要注意以下幾點(diǎn)：①要對(duì)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域進(jìn)行嚴(yán)格區(qū)分，不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域采取不同的專屬器械；②在樣品提取后能夠進(jìn)行立刻檢測(cè)的要進(jìn)行立刻檢測(cè)，否則會(huì)降低檢驗(yàn)的準(zhǔn)確率，如果無(wú)法立即進(jìn)行檢測(cè)要進(jìn)行冷凍保存；③整個(gè)檢測(cè)過(guò)程要在低溫環(huán)境下進(jìn)行；④移動(dòng)液也進(jìn)行嚴(yán)密的校準(zhǔn)，操作過(guò)程要熟練，防止發(fā)生遺漏事件的發(fā)生；⑤要注重檢測(cè)過(guò)程中的污染問(wèn)題，采取75%的乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面進(jìn)行擦拭，對(duì)周圍環(huán)境采取紫外線消毒，以減少污染的發(fā)生[9]；⑥另外，相關(guān)研究也證明[10]，盡管檢測(cè)流感病毒核酸的試劑和儀器很多，但是并不是所有的試劑與儀器都能達(dá)到的最好的匹配，因此，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)還要多次進(jìn)行校準(zhǔn)試驗(yàn)，針對(duì)不同的試劑和儀器進(jìn)行匹配性試驗(yàn)比較，找出最佳匹配方案，使實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果更加快速、準(zhǔn)確，敏感性、特異性更高。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種科學(xué)有效的檢測(cè)方法，可對(duì)流感病毒核酸進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，分析流感病毒的流行規(guī)律，有效預(yù)防突發(fā)公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。

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R440

A

1672-5654（2014）10（a）-0178-02

2014-08-05）

周雪花（1977-），女，漢族，本科，主管檢驗(yàn)師，云南文山人，主要從事臨床檢驗(yàn)，微生物檢驗(yàn)工作。