響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄醋發(fā)酵條件的研究

王璐，閻曉菲，李艷云，李曉鵬，梁旭，宰雪平，古麗娜孜，武運(yùn)*

響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄醋發(fā)酵條件的研究

王璐1，閻曉菲2，李艷云2，李曉鵬2，梁旭2，宰雪平2，古麗娜孜1，武運(yùn)1*

果醋一般是以次果和果品加工的下腳料為原料，經(jīng)現(xiàn)代生物技術(shù)釀制而成[1-3]。葡萄醋是以葡萄為主要發(fā)酵原料釀造的一種營養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸味調(diào)味品。不僅具有增進(jìn)食欲、促進(jìn)消化、保護(hù)皮膚、解除疲勞等優(yōu)點(diǎn)，還具有相應(yīng)原料的保健功能，已成為新一代的健康飲品[4-8]。葡萄醋起源于歐洲，是歐美食醋中的最優(yōu)品種，在法國、意大利、西班牙等葡萄酒釀造大國，葡萄醋也十分盛行[9]。我國的糧食釀造醋及果醋的品種繁多，但葡萄醋與國外相比品種開發(fā)較少，并且缺乏高品質(zhì)的葡萄醋。

隨著市場(chǎng)需求量增大以及農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，新疆赤霞珠葡萄種植面積逐年擴(kuò)大，成為新疆釀酒葡萄第一主栽品種，一定程度上帶動(dòng)了新疆經(jīng)濟(jì)的發(fā)展?，F(xiàn)階段，赤霞珠主要是以葡萄原酒的形式出售，缺少特色，附加值低；如果能利用赤霞珠葡萄發(fā)酵成葡萄醋飲品出售，不僅可增加飲料的品種，并且可以減少在貯藏過程中因變質(zhì)而造成的浪費(fèi)，還可提高新疆赤霞珠葡萄的綜合經(jīng)濟(jì)效益。

本研究以新疆地產(chǎn)新鮮釀酒葡萄赤霞珠為原料，將其清洗、破碎后經(jīng)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵釀制葡萄紅醋，通過響應(yīng)面法對(duì)醋酸發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在研究適合于赤霞珠葡萄醋的醋酸發(fā)酵條件，為工業(yè)化、機(jī)械化生產(chǎn)葡萄醋提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠：新疆阜康市釀酒葡萄園區(qū)。

酵母菌、醋酸菌：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

檸檬酸：天津市福晨化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無水乙醇：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；酚酞：天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；果膠酶：南寧龐博生物工程有限公司；亞硫酸鈉：天津市富通化工有限公司。

醋酸菌培養(yǎng)基：1%葡萄糖，1%酵母膏，1.5%碳酸鈣，配制固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，配制固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-781型電熱恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；LHS-150SC恒溫恒濕箱、THI-98A恒溫振蕩箱：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1Cu型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州進(jìn)化設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋、SXKW數(shù)顯控溫電熱套：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；YBFJ110酒精計(jì)：冀州市耀華器械儀表廠；WFI-J型手持測(cè)糖儀：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

原料處理：剔除腐爛變質(zhì)的葡萄顆粒，選擇新鮮、顆粒飽滿的赤霞珠葡萄。

破碎：使用打漿機(jī)對(duì)原料進(jìn)行破碎，加入H2SO3100 mg/L[10]。

酶解：加入一定量的果膠酶，在35℃酶解3 h，提高果汁產(chǎn)量，縮短加工時(shí)間[11]。

調(diào)節(jié)果汁：使用蔗糖將糖度調(diào)至18°Bx，用檸檬酸和NaOH調(diào)節(jié)酸度至pH 3.5～4.0[12]。

種子發(fā)酵液：將4℃條件下保存的酵母菌與醋酸菌菌種在無菌環(huán)境中接種于YPD培養(yǎng)基和醋酸培養(yǎng)基中活化，分別置于28～32℃培養(yǎng)48 h，以備后期使用。

母發(fā)酵液：將預(yù)處理好的葡萄汁分裝于三角瓶中，在無菌條件下，將已活化好的酵母菌與醋酸菌種子發(fā)酵液按5%接種量接入三角瓶中，搖勻，分別置于28～32℃培養(yǎng)48h，以備后期使用。

酒精發(fā)酵：將6%酵母菌母發(fā)酵液加入葡萄汁中，31℃發(fā)酵6 d，得到酒精度為11.5%vol的酒精發(fā)酵液。

醋酸發(fā)酵：將醋酸菌母發(fā)酵液按一定量加入發(fā)酵液中，在適宜的條件下進(jìn)行發(fā)酵。

澄清：將發(fā)酵產(chǎn)品于2500r/min離心10min，取上清液。滅菌：采用巴氏殺菌法，75℃殺菌15～20 min。

1.3.3 葡萄醋發(fā)酵單因素試驗(yàn)

分別選取醋酸菌接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、發(fā)酵溫度（24℃、26℃、28℃、30℃、32℃）、發(fā)酵時(shí)間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）三個(gè)因素進(jìn)行醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)，并對(duì)醋酸發(fā)酵液進(jìn)行酸度的測(cè)定。

1.3.4 葡萄醋發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design設(shè)計(jì)原理，以酸度為響應(yīng)值（Y），接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為影響因素，利用響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平編碼值如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平編碼值Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.5 測(cè)定方法

酸度測(cè)定：參照國標(biāo)GB/T 12293—90《水果、蔬菜制品可滴定酸度的測(cè)定》中的酸堿中和滴定法；酒精度測(cè)定采用GB/T15038—2006《葡糖酒、果酒通用試驗(yàn)方法》中的酒精蒸餾法；可溶性固形物測(cè)定：手持糖度計(jì)；殘?zhí)呛繙y(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法；菌落總數(shù)、大腸菌群測(cè)定采用GB/T 4789.3—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》中的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

將酒精發(fā)酵液的酒精度調(diào)整為11%vol，分別以2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種醋酸菌母發(fā)酵液，30℃培養(yǎng)6 d，每隔1 d取樣測(cè)定發(fā)酵液酸度，結(jié)果見圖1。

圖1 接種量對(duì)醋酸發(fā)酵液酸度的影響Fig.1 Effect of inoculum on acidity of acetic acid fermented liquid

由圖1可看出，不同的醋酸菌接菌量對(duì)發(fā)酵液酸度的影響很大。隨著接種量的增大，發(fā)酵速度和產(chǎn)酸量也相應(yīng)提高，但當(dāng)接種量過大（達(dá)到8%～10%）時(shí)，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)在發(fā)酵前期過多的用于醋酸菌細(xì)胞的增值上，發(fā)酵前3d酸度高于其他接種量，而在發(fā)酵第4～6天，由于發(fā)酵底物減少，酸度增加量較少；當(dāng)接種量為6%發(fā)酵第6天時(shí)，發(fā)酵液酸度最高為5.5 g/100mL。綜上所述，選取4%、6%、8%作為響應(yīng)面取值范圍。

2.1.2 溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

將酒精發(fā)酵液的酒精度調(diào)整為11%vol，接種6%醋酸菌母發(fā)酵液，分別以24℃、26℃、28℃、30℃、32℃的發(fā)酵溫度培養(yǎng)6 d，每隔1 d取樣測(cè)定發(fā)酵液酸度，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液酸度的影響Fig.2 Effect of temperature on acidity of acetic acid fermented liquid

由圖2可看出，發(fā)酵溫度會(huì)直接影響醋酸菌的繁殖速度和產(chǎn)酸速度，若發(fā)酵溫度過低會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵速度緩慢，產(chǎn)酸量低；若發(fā)酵溫度過高，則會(huì)造成醋酸菌提前老化，使酒精轉(zhuǎn)化率變低[7]。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，發(fā)酵第2天不同發(fā)酵溫度的酸度差異較小，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長變化趨于明顯，28℃的醋酸發(fā)酵液酸度比其他發(fā)酵液酸度高，28℃發(fā)酵液在第6天時(shí)的酸度為5.3 g/100mL，綜上所述，選取26℃、28℃、30℃作為響應(yīng)面取值范圍。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

將酒精發(fā)酵液的酒精度調(diào)整為11%vol，接種6%醋酸菌母發(fā)酵液，28℃條件下培養(yǎng)至第10天，從第2天開始，每隔1 d取樣測(cè)定發(fā)酵液酸度，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液酸度的影響Fig.3 Effect of fermentation time on acidity of acetic acid fermented liquid

由圖3所示，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在第2～6天時(shí)，酸度增加量明顯，變化趨勢(shì)較大，發(fā)酵到第6天時(shí)酸度達(dá)到5.5 g/100mL，在發(fā)酵第7～10天，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長酸度變化趨于平緩，酸度變化量較小。綜上所述，選取第5天、第6天、第7天作為響應(yīng)面取值范圍。

2.2 赤霞珠葡萄紅醋醋酸發(fā)酵響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.05進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別見表2和表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)及響應(yīng)值Table 2 Experimental design and corresponding response value

按照表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，可建立以醋酸發(fā)酵液酸度對(duì)接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）的擬合方程為：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析Table 3 Results and variance analysis of response surface experiment

響應(yīng)面回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，由P值來判定，P值越小，則相對(duì)應(yīng)變量的顯著程度越高[13]。由表3可知，當(dāng)模型F=25.28時(shí)，P=0.000 2＜0.01，說明模型是極顯著的。當(dāng)失擬項(xiàng)F=0.052時(shí)，P=0.982 0＞0.05，說明模型失擬項(xiàng)不顯著，由此可以說明模型建立呈顯著性。決定系數(shù)R2=0.970 2，校正系數(shù)R2Adj=0.931 8，表明醋酸發(fā)酵液中酸度的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合度，試驗(yàn)操作準(zhǔn)確可信，可以利用此模型對(duì)赤霞珠紅醋醋酸發(fā)酵過程進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

從表3可以看出，一次項(xiàng)與交互項(xiàng)AB表現(xiàn)出顯著水平，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)AC、BC對(duì)赤霞珠紅醋的Y值影響表現(xiàn)出極顯著水平。試驗(yàn)結(jié)果可以得出各因素對(duì)赤霞珠紅醋酸酸度的影響順序?yàn)锳＞C＞B，接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度。

2.2.2 響應(yīng)面圖與等高線圖分析[14-15]

各因素對(duì)醋酸發(fā)酵液酸度的影響和各因素之間的交互作用見圖4。從圖4可以看出，隨著接種量的增大，發(fā)酵溫度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，接種量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

圖4 各因素相互作用對(duì)赤霞珠葡萄醋酸發(fā)酵酸度影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour line of effect of interaction between every two factors on acidity of Cabernet Sauvignon acetic acid fermentation

通過Design-Expert 8.05軟件，根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，可得出醋酸發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件為接種量6.42%、發(fā)酵溫度27.97℃、發(fā)酵時(shí)間5.78 d，在此條件下醋酸發(fā)酵液酸度可達(dá)5.79 g/100 mL。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)該法可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)考慮實(shí)際操作的方便，將發(fā)酵工藝參數(shù)修正為接種量6%、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時(shí)間6 d，經(jīng)過3組平行試驗(yàn)，最終得到的酸度平均值為5.82 g/100 mL，與理論值相對(duì)誤差差值較小，可見該模型準(zhǔn)確可靠，利用該模型在實(shí)踐中進(jìn)行預(yù)測(cè)是可行的，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.3 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

感官評(píng)指標(biāo)、理化指標(biāo)符合國標(biāo)GB 18187—2000《中華人民共和國釀造食醋國家標(biāo)準(zhǔn)》的要求；微生物指標(biāo)符合國標(biāo)GB2719—2003《中華人民共和國釀造食醋衛(wèi)生國家標(biāo)準(zhǔn)》的要求。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面軟件，對(duì)赤霞珠葡萄紅醋醋酸發(fā)酵條件進(jìn)行模型建立和模型預(yù)測(cè)，得出最佳醋酸發(fā)酵條件為接種量為6%，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間為6 d，最終得到的酸度為5.82 g/100 mL。

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（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

為探究赤霞珠葡萄醋醋酸發(fā)酵規(guī)律，以新疆特色赤霞珠葡萄為原材料，采用響應(yīng)面法對(duì)赤霞珠葡萄紅醋醋酸發(fā)酵的發(fā)酵條件（接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件為醋酸菌接種量6%，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間為6 d，發(fā)酵得到赤霞珠葡萄醋總酸可達(dá)到5.79 g/100 mL。

赤霞珠；葡萄醋；響應(yīng)面分析；醋酸發(fā)酵

Optimization of grape vinegar fermentation conditions by response surface methodology

WANG Lu1,YAN Xiaofei2,LI Yanyun2,LI Xiaopeng2,LIANG Xu2,ZAI Xueping2,GU Linazi1,WU Yun1*
(1.College of Food Sciences and Pharmaceutical Sciences,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.College of Science and Technology,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

In order to explore Cabernet Sauvignon grape acetic fermentation law,using Cabernet Sauvignon grapes in Xinjiang area as raw material, the fermentation conditions(inoculum,fermentation temperature and fermentation time)was optimized by response surface methodology.Result showed that the optimized conditions were as follows:acetic acid bacteria inoculum 6%,fermentation temperature 28℃,fermentation time 6 d,under the condition,the total acidity of the Cabernet Sauvignon vinegar was 5.79 g/100mL.

Cabernet Sauvignon;grape vinegar;response surface analysis;acetic fermentation

TS255.47

A

0254-5071（2014）07-0055-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.012

2014-04-28

新疆維吾爾自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（201431113）；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（2013kcx01）

王璐（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

*通訊作者：武運(yùn)（1965-），教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。