米曲霉不同培養(yǎng)方式的發(fā)酵探究

肖君，甄玉國，2*，王曉磊（.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院吉農(nóng)博瑞奶牛研發(fā)中心，吉林長春308；2.長春博瑞飼料集團有限公司技術(shù)中心，吉林長春304）

米曲霉不同培養(yǎng)方式的發(fā)酵探究

肖君1，甄玉國1，2*，王曉磊1
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院吉農(nóng)博瑞奶牛研發(fā)中心，吉林長春130118；2.長春博瑞飼料集團有限公司技術(shù)中心，吉林長春130114）

利用10 L發(fā)酵罐在搖瓶實驗基礎(chǔ)上進(jìn)行了米曲霉（Aspergillus oryzae）放大實驗。根據(jù)不同菌體形態(tài)對代謝產(chǎn)物的影響，在米曲霉菌絲生長到絮狀前，終止發(fā)酵。指數(shù)補料實驗結(jié)果表明，分批發(fā)酵在第14小時菌體干質(zhì)量達(dá)到最大值15.06 g/L，比搖瓶發(fā)酵提高了33%；指數(shù)補料在第16小時菌體干質(zhì)量達(dá)到20.43 g/L，比分批發(fā)酵提高26%。

米曲霉；發(fā)酵罐；指數(shù)補料

米曲霉（Aspergillus oryzae）是一種好氣性真菌，分類學(xué)歸屬于半知菌亞門、曲霉屬。米曲霉為典型的絲狀真菌，菌絲一般呈黃綠色，酸度較大的培養(yǎng)基上呈綠色，酸度較小的培養(yǎng)基上呈黃色，老化后逐漸為褐色[1]。絲狀真菌在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛，其在發(fā)酵過程中一般存在球狀、絮狀、團塊狀3種形態(tài)，不同代謝產(chǎn)物所適宜的形態(tài)不同，在不同形態(tài)下，代謝產(chǎn)物的積累差異明顯，團塊狀的菌體形態(tài)在發(fā)酵過程中接種量難于控制，且極大地限制了菌體內(nèi)部的傳氧、傳質(zhì)，產(chǎn)物產(chǎn)量明顯偏低，一般不選用[2]；絮狀菌體營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣在其內(nèi)部傳輸較為順利，但其能增加發(fā)酵液黏度，形成假塑型流體，降低物質(zhì)、氧氣在發(fā)酵液中的傳遞效率，同時還極易纏繞攪拌槳，使發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量、發(fā)酵罐性能降低。

甘蔗糖蜜是甘蔗制糖的副產(chǎn)品，含有大量的蔗糖，總糖約40%～60%，同時含有大量的有機和無機膠體物質(zhì)、鹽類及泥沙等，是一筆巨大而可觀的可發(fā)酵性資源[3]。

發(fā)酵罐深層發(fā)酵是與搖瓶發(fā)酵不同的培養(yǎng)方式，在搖瓶培養(yǎng)中得到的菌絲體及其次級代謝產(chǎn)物含量，一旦放大到發(fā)酵罐中情況就有所不同[4]。

為建立米曲霉液體培養(yǎng)生物量最大的技術(shù)，以糖蜜為底物，發(fā)酵時間控制在菌體對數(shù)期末期，形態(tài)為液體，為工業(yè)化生產(chǎn)米曲霉代謝物組的生物制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）：吉農(nóng)博瑞奶牛研發(fā)中心實驗室分離。

斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[5]：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，自來水1 000 mL，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：尿素0.4%，蛋白胨0.3%，磷酸氫二鉀0.16%，硫酸鎂0.07%，氯化鈉0.05%，硫酸鐵0.05%。

葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈉、蒽酮等均為分析純：北京化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BLBIO-10L發(fā)酵罐：上海百倫生物科技有限公司；GI80T全自動立式高壓滅菌鍋：廈門致微儀器有限公司；GZX-9070MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-2C型數(shù)顯酸度計：上海SANXIN公司；HZP-150型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SPX-150型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；島津UV-1201分光光度計：日本島津公司；SW-CJ-IF型潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 米曲霉菌種孢子懸浮液制備

（1）用生理鹽水將平板上的孢子（培養(yǎng)72 h）洗脫，放入裝有滅過菌的玻璃攪拌珠（起打散作用）的三角瓶中之后磁力攪拌器，200 r/min的振蕩20 min。

（2）無菌操作臺5層無菌紗布過濾培養(yǎng)液以除去培養(yǎng)液中的菌絲體，調(diào)節(jié)孢子濃度為1×106CFU/mL，4℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.3.2 生長曲線的測定

在10L發(fā)酵罐中裝液量為6L，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100r/min，通氣量最大為60L/h，溫度37℃，接種量為8%的5×106CFU/mL孢子懸浮液，pH值采用自動流加2 mol/L的NaOH控制在6.0，發(fā)酵周期為18 h，每2 h取樣1次，分別測定米曲霉的生物量和殘?zhí)堑暮?。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，生物量、殘?zhí)菫榭v坐標(biāo)繪制分批發(fā)酵的代謝曲線。

1.3.3 分批發(fā)酵

發(fā)酵罐參數(shù)：在10 L發(fā)酵罐中裝液量為6 L，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min，通氣量最大為60 L/h，溫度37℃，接種量為8%的5×106CFU/mL孢子懸浮液，pH值控制在6.0，采用自動流加2 mol/L的NaOH，發(fā)酵周期為18 h，每2 h取樣1次，測定米曲霉的生物量和殘?zhí)堑暮?。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，生物量、殘?zhí)菫榭v坐標(biāo)繪制分批發(fā)酵的代謝曲線。

1.3.4 指數(shù)補料

發(fā)酵罐參數(shù)：在10 L發(fā)酵罐中裝液量為6 L，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100 r/min，通氣量最大為60 L/h，溫度37℃，接種量為8%的5×106CFU/mL孢子懸浮液，pH值控制在6.0，采用自動流加2 mol/L的NaOH，在發(fā)酵的第11小時開始指數(shù)補加糖蜜F=67 mL/h，每2 h取樣一次，分別測定米曲霉的生物量和殘?zhí)堑暮?。發(fā)酵培養(yǎng)基的初始糖的質(zhì)量濃度為60 g/L。補加糖蜜的糖質(zhì)量濃度為400 g/L。糖蜜采用流加方式補入發(fā)酵罐，以提前設(shè)定的速度指數(shù)流加。流加速度用罐體的蠕動泵來控制，流加速度計算公式：

式中：F表示流加速度，L/h；v是初始體積，L；X0代表細(xì)胞濃度，g/L；u是比生長速率，h-1；t是時間，h；S0是糖補料液的質(zhì)量濃度，g/L；Yx/s是糖對細(xì)胞產(chǎn)率系數(shù)；exp是指數(shù)函數(shù)[7]。

1.3.5 菌體干質(zhì)量的考察

將發(fā)酵液進(jìn)行真空抽濾，蒸餾水洗滌3次，濾紙連同菌體置于烘箱中105℃烘干至質(zhì)量恒定。精確稱量菌體干質(zhì)量，以其來衡量米曲霉的生物量[8-9]。

1.3.6 糖含量的測定與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

糖含量的測定采用蒽酮比色法。精確稱取干燥后的葡萄糖0.5 g加蒸餾水溶解，定容至50 mL，制成質(zhì)量濃度10 g/L的葡萄糖溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取6支試管，分別吸取質(zhì)量濃度為10g/L的葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置于10 mL試管中，在每支試管中立即加入蒽酮試劑5.0 mL，搖勻后煮沸10 min取出，冷卻至室溫。在波長620 nm處，以第一管為空白，測其余各管吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度值y為縱坐標(biāo)，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 樣品中糖含量的測定

取兩支試管加樣1 mL（0.2 mL樣+0.8 mL蒸餾水），加蒽酮5 mL，搖勻后沸水浴中10 min，冷卻后于波長620 nm處測定吸光度值[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用紫外分光光度計在波長490 nm處測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：y=0.006 8x+ 0.0079，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，在1～100μg/mL線性關(guān)系良好。

2.2 米曲霉生長曲線的測定

測定生長曲線的實驗條件如1.3.2。圖2為米曲霉的生長曲線，培養(yǎng)時間為26 h，生物量達(dá)到12.99 g/L。在對數(shù)期末期時，菌體大量繁殖使得發(fā)酵液黏稠。由于發(fā)酵液黏稠就很難使其混合均勻，至使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)、溶解氧、pH值、CO2、溫度等在發(fā)酵罐中出現(xiàn)差異[11]。所以本研究發(fā)酵終止在菌體生長的對數(shù)期末期。

圖2 米曲霉生長曲線Fig.2 Growth curve ofA.oryzae

2.3 分批發(fā)酵代謝曲線

分批發(fā)酵的實驗條件如1.3.3，代謝曲線見圖3。

圖3 分批發(fā)酵代謝曲線Fig.3 Batch fermentation metabolic curve

由圖3可知，0～4 h時菌體干質(zhì)量較少，菌體處于適應(yīng)期。4～14 h菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體干質(zhì)量迅速增加，在14 h時達(dá)到最大值15.06 g/L。

殘?zhí)乔€：0～4 h時菌體生長代謝活動較弱，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度變化較小。4～14 h進(jìn)入對數(shù)生長期后菌體迅速利用蔗糖進(jìn)行生長繁殖，同時代謝活動也在加強，殘?zhí)橇垦杆傧陆?。在?4小時下降至25.51 g/L，直至發(fā)酵末期殘?zhí)橇炕静辉僮兓?/p>

2.4 指數(shù)補料代謝曲線

圖4 指數(shù)補料代謝曲線Fig.4 Exponential feeding metabolic curve

指數(shù)補料發(fā)酵的實驗條件如1.3.4，指數(shù)補料過程中補加糖蜜時米曲霉的生物量、發(fā)酵罐中糖含量的變化情況見圖4。

由圖4可知，0～11 h菌體干質(zhì)量變化較平穩(wěn)，11～16 h干質(zhì)量迅速增加。

殘?zhí)乔€：在發(fā)酵的0～11h內(nèi)發(fā)酵罐中的殘?zhí)橇坑?9g迅速降至43 g，在第11小時進(jìn)行糖蜜的補料，補料的流加速度F=67 mL/h。

在發(fā)酵的第12小時通過指數(shù)補料有利于米曲霉菌體的生長，因此，在培養(yǎng)16 h之后，發(fā)酵液中可以達(dá)到極高的菌體濃度。米曲霉的生物量迅速的增加，最高為20.43 g/L。

3 結(jié)論

在搖瓶培養(yǎng)基礎(chǔ)上比較10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵和指數(shù)補料發(fā)酵二種培養(yǎng)模式：10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵在未進(jìn)行補料情況下米曲霉生物量達(dá)到15.06 g/L。由于分批補料缺乏營養(yǎng)補給而造成生長密度有限，菌體形態(tài)不同[12-13]也不利于氧的傳遞，難以實現(xiàn)細(xì)胞的高密度[14-15]。

10 L發(fā)酵罐指數(shù)補料發(fā)酵基于微生物指數(shù)生長理論通過指數(shù)流加糖蜜使得米曲霉大量快速生長。實驗結(jié)果表明，10 L發(fā)酵罐中通過指數(shù)補料在保持菌體形態(tài)同時使得米曲霉生物量最大化，達(dá)到20.43 g/L。

[1]趙飛龍，徐亞軍.米曲霉的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國釀造，2006，25（3）：8-10.

[2]徐晴，黃和，李霜，等.深層發(fā)酵中絲狀真菌菌球形態(tài)控制的策略[J].食品科技，2009，34（2）：13-17.

[3]陳杰，陳瑜，閆杰，等.老抽醬油產(chǎn)生沉淀的原因及糖蜜的除雜處理[J].食品工業(yè)科技，2002，23（2）：72-74.

[4]潘艷，付璐，劉斯淼，等.富硒米曲霉發(fā)酵罐放大實驗的研究[J].中國調(diào)味品，2010（3）：51-52.

[5]楊勇，張鳳英，陳岑.PDA培養(yǎng)基改良配方的研究[J].釀酒科技，2012（4）：29-31

[6]王霞，劉麗華，張霞，等.氨基?；府a(chǎn)生菌米曲霉發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].化學(xué)與生物工程，2010，27（4）：67-68.

[7]灑榮波，石貴陽，唐瑜菁.不同補料發(fā)酵方式對重組畢赤酵母高密度培養(yǎng)的影響[J].食品工業(yè)科技，2010，31（11）：210-211.

[8]張李陽.固體發(fā)酵紅曲霉菌生物量測定方法的研究南[J].京曉莊學(xué)院學(xué)報，2002，18（4）：6-11.

[9]邵偉，王棟，唐明，等.紅曲霉產(chǎn)蛋白酶特性研究[J].中國釀造，2006，25（5）：34-37.

[10]武平，趙文婧，徐曉嬌，等.測定葡萄酒中總糖方法的探討[J].中國釀造，2011，30（1）：163-165.

[11]楊海龍，吳天祥，章克昌.絲狀真菌發(fā)酵生產(chǎn)中形態(tài)的影響與發(fā)酵罐設(shè)計[J].生物技術(shù)，2003，13（1）：45-47.

[12]HAACK M B,OLSSON L,HANSEN K,et al.Change in hyphal morphologyofAspergillusoryzaeduringfed-batchcultivation[J].Appl Microbiol Biot,2006,70(4):482-487.

[13]熊強，徐晴，顧帥，等.絲狀真菌形態(tài)控制及其在發(fā)酵過程優(yōu)化中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報，2012，28（2）：178-190.

[14]謝子文，王紅寧.畢赤酵母工程菌產(chǎn)植酸酶補料分批發(fā)酵研究[J].中國釀造，2007，26（6）：9-13.

[15]汪嶸，趙穎怡，張云開，等.高密度培養(yǎng)基因工程菌的條件優(yōu)化[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2002，21（1）：58-59.

Exploration ofAspergillus oryzaefermentation with different cultivate modes

XIAO Jun1,ZHEN Yuguo1,2*,WANG Xiaolei1

(1.JAU-Borui Dairy Science and Technolgy R&D Center,College Animal Science&Technology,Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China;2.Technolgy Center of Changchun Borui Feed Co.,Ltd.,Changchun 130114,China)

Based on the shake flasks results,scaling up experiment ofAspergillus oryzaein 10 L fermentor was conducted.According to the effect of different mycelial morphology on the metabolite,fermenting should be stopped beforeA.oryzaehypha growing into flocculent.The exponential feeding results showed that the cell dry weight could reach 15.06 g/L when cultivated by batch fermentation for 14 h,which was 33%higher than shake flask culture.At the 16 h of fermentation,the cell dry weight was 20.43 g/L by exponential feeding,which was 26%higher than batch fermentation.

Aspergillus oryzae;fermentor;exponential feeding

TS201.3

A

0254-5071（2014）07-0048-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.010

2014-05-14

吉林省重大科技攻關(guān)項目資助（2012ZDGG006）

肖君（1989-），男，碩士研究生，研究方向為反芻動物營養(yǎng)。

*通訊作者：甄玉國（1970-），男，副教授，博士，研究方向為反芻動物營養(yǎng)。