釀酒酵母有氧發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

趙小麗，甄玉國*，王蘭惠，易曉菲

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學吉農(nóng)博瑞奶牛飼料研發(fā)中心，吉林長春130118；2.長春博瑞飼料集團有限公司技術(shù)中心，吉林長春130114）

釀酒酵母有氧發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

趙小麗1，2，甄玉國1，2*，王蘭惠1，易曉菲1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學吉農(nóng)博瑞奶牛飼料研發(fā)中心，吉林長春130118；2.長春博瑞飼料集團有限公司技術(shù)中心，吉林長春130114）

以實驗室選育的酵母菌為試驗用菌株，以甜菜糖蜜為碳源發(fā)酵生產(chǎn)酵母菌體，通過單因素和正交試驗優(yōu)化實驗室搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基，優(yōu)化后的培養(yǎng)基為總糖含量為10%的糖蜜、10%紅糖、0.50%尿素、0.50%酵母粉、0.05%硫酸鎂、0.05%甘氨酸，在此培養(yǎng)條件下，菌體干質(zhì)量可達到16.83 g/L。

甜菜糖蜜；酵母菌；培養(yǎng)基

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為人類利用最早的微生物，其營養(yǎng)成分十分豐富，含有菌體蛋白質(zhì)、多種氨基酸、維生素、脂肪、食物纖維、礦物元素及生理活性物質(zhì)等[1]。酵母細胞蛋白構(gòu)成比較理想，氨基酸種類豐富，尤其是賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸[2-3]，由于其具有安全、生長繁殖快、代謝周期短、生產(chǎn)不受季節(jié)和氣候、土壤、自然災害的影響，可以在工廠里進行，與傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式相比，過程易于控制，容易進行大規(guī)模培養(yǎng)、菌體蛋白質(zhì)豐富等優(yōu)點，一直是基礎和應用研究的主要對象，并被廣泛應用于釀造、食品、醫(yī)藥、飼料工業(yè)等領域[4-6]。

糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，是一種黏稠、黑褐色、呈半流動的物體，糖蜜含有大量的糖、蛋白質(zhì)和多種礦物質(zhì)、維生素、纖維素、胺類等，是微生物進行發(fā)酵的理想復合原料[7]。因此，利用糖蜜來生產(chǎn)飼料酵母不僅能提高糖蜜的附加值，而且可以充分利用廢棄物，有效地保護環(huán)境，降低飼料生產(chǎn)企業(yè)的成本。飼料酵母所含的營養(yǎng)物質(zhì)極為豐富，酵母含有易被畜禽吸收的必需氨基酸、B族維生素、礦物質(zhì)元素等成分，是飼料蛋白質(zhì)的有效補充物，作為蛋白質(zhì)飼料添加到配合飼料中，具有和魚粉相同的功效[8]。

本試驗通過單因素和正交試驗設計，研究以甜菜糖蜜為碳源發(fā)酵生產(chǎn)高生物量酵母的培養(yǎng)基的最優(yōu)組合，為工業(yè)化生產(chǎn)飼料酵母提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

實驗室前期試驗獲得，經(jīng)分子生物學鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

1.1.2 材料

甜菜糖蜜：黑龍江拜泉糖廠；紅糖（食品級）：市售。

1.1.3 試劑

尿素、甘氨酸、硫酸鎂：北京化工廠；葡萄糖、瓊脂、酵母浸粉、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

酵母斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂15 g/L，121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

酵母液體種子培養(yǎng)基—酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

pHS-2C型數(shù)字式酸度計：上海SANXIN公司；AL104電子天平：梅特勒-托利多公司；島津UV-1201分光光度計：日本島津公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機：德國艾本德股份公司；YP1200型電子天平：上海精科實業(yè)有限公司。HYG-型培養(yǎng)搖床：上海欣蕊自動化設備有限公司；SPX-150型生化培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-IF型潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及擴大培養(yǎng)

無菌條件下接一環(huán)保藏菌種至YPD斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48h復蘇菌種。取一環(huán)活化后的斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝液量為20 mL/100 mL的種子培養(yǎng)基中30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。1.3.2生長曲線的繪制

將斜面保存的優(yōu)勢菌株挑取一環(huán)接種于500 mLYPD培養(yǎng)基中，裝液量20mL/100mL，在水浴搖床中30℃、180r/min培養(yǎng)，每隔2 h在無菌操作條件下取樣，在波長560 nm處測定吸光度值，以吸光度值為縱坐標、培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.3.3 菌體密度測定

菌液經(jīng)適當稀釋后用紫外可見分光光度計在波長560 nm處測定吸光度值。

1.3.4 菌體生物量測定

發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌2次后收集菌體，105℃烘干至質(zhì)量恒定，稱量并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.5 單因素試驗

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20mL/100mL，30℃、4%接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基選取糖蜜濃度、氮源、無機鹽、生長因子等，研究其對菌株生物量的影響。

1.3.6 培養(yǎng)基條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對菌體生物量影響較大的因素設計正交試驗，研究發(fā)酵條件的最佳優(yōu)化組合。

1.3.7 試驗數(shù)據(jù)

采用SPSS17.0軟件，Duncan’s進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子液生長曲線的繪制

圖1 釀酒酵母生長曲線Fig.1 Growth curves ofSaccharomyces cerevisiae

測定酵母的生長曲線不但可以清楚的了解酵母的對數(shù)生長期、衰亡期以及它的一些生長特性，還可以得出酵母繁殖到最大量的時間以及在隨后的生長過程中酵母細胞是否會產(chǎn)生自溶影響單細胞蛋白的生產(chǎn)從而更好的進行單細胞蛋白生產(chǎn)[9]，釀酒酵母生長曲線見圖1。

由圖1可知，在0～6 h處于延滯期，6～18 h處于對數(shù)生長期，18～30 h基本處于穩(wěn)定期，隨著培養(yǎng)時間的延長，部分菌體開始死亡，由于死亡的菌體和活的菌體不能夠分離開來，所以在生長曲線上看不到菌的衰退期，而且在穩(wěn)定期時，從總的吸光度值上看，是略呈增長的趨勢，只是漲幅很小。因此當制備種子液的時候在同樣培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)到20 h左右即可。

2.2 培養(yǎng)基單因素篩選結(jié)果

2.2.1 糖蜜總糖含量對菌體生物量的影響

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20mL/100mL，30℃、4%接種量、150r/min搖床培養(yǎng)24h，將糖蜜總糖含量分別設定為4%、6%、8%、10%、12%五個梯度，考察糖蜜總糖含量對菌體生物量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 糖蜜總糖含量對菌體生物量的影響Fig.2 Effect of molasses total sugar content on cell biomass

由圖2可知，隨著糖蜜總糖含量的增加，吸光度值也隨之增加，當含量達到10%時增長變緩，經(jīng)方差分析，12%與10%兩組間差異不顯著（P>0.05），所以糖蜜含量選為10%，從糖對菌體生物量的轉(zhuǎn)化率和經(jīng)濟成本的角度考慮，高濃度糖轉(zhuǎn)化率低，另外從糖濃度對酵母菌增殖的影響，高濃度糖在酵母增殖到穩(wěn)定期時比低濃度糖過早表現(xiàn)出糖抑制作用，可能是因為高濃度糖使酵母菌能夠快速達到對數(shù)期，伴隨酵母菌快速增長的同時，代謝產(chǎn)物也快速積累，一些有抑制作用的代謝物快速達到其發(fā)揮抑制作用的濃度，從而阻礙酵母菌的增殖，相對初始糖濃度來說增大了殘?zhí)橇?，造成原料的浪費，增加了投入成本，綜合以上各因素，選擇10%的糖蜜含量作為適宜的碳源濃度。

2.2.2 氮源對菌體生物量的影響

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20mL/100mL，30℃、4%接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，糖蜜含量10%、在保證含氮量相同的前提下考察有機氮源（蛋白胨0.33%、干酪素0.35%、大豆蛋白胨0.51%、酪蛋白胨0.39%、胰蛋白胨0.38%）及無機氮源（硫酸銨0.23%和尿素0.1%）對菌體生物量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同氮源對菌體生物量的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on cell biomass

由圖3可知，無機氮源尿素對菌體生物量的增加效果最好，可能是因為微生物對無機氮源的吸收一般比有機氮源快，并且對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH具有重要作用[10-11]，因此選擇尿素作為氮源。

2.2.3 尿素添加量對菌體生物量的影響

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20mL/100mL，30℃、4%接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，糖蜜含量10%、考察尿素添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）對菌體生物量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 尿素不同添加量對菌體生物量的影響Fig.4 Effect of urea addition on cell biomass

由圖4可知，隨著尿素添加量的增加，發(fā)酵液中氮源過量，發(fā)酵液的環(huán)境發(fā)生改變，抑制了酵母細胞的正常生長繁殖[12-13]，菌體生物量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，經(jīng)單因素方差分析0.50%組與各組之間均差異顯著（P<0.05），因此尿素的添加量選為0.5%。

2.2.4 磷酸二氫鉀不同添加量對菌體生物量的影響

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20mL/100mL，30℃、4%接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量為0.50%，考察磷酸二氫鉀添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）對菌體生物量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 磷酸二氫鉀不同添加量對菌體生物量的影響Fig.5 Effect of potassium dihydrogen phosphate addition on cell biomass

由圖5可知，隨著磷酸二氫鉀添加量的增加，菌體生物量呈現(xiàn)下降趨勢，與所報道的結(jié)果不一致[14]，可能是因為甜菜糖蜜是一種富含多種營養(yǎng)組分的物質(zhì)，另外由于甜菜的產(chǎn)地和制糖工藝的不同，其中磷的含量也不同，另外由于試驗目的不同，碳源所選糖蜜濃度不同，初始培養(yǎng)條件不同等多種因素綜合在一起，使得糖蜜中所含的磷就足以滿足當前條件下菌體生長的需要，額外再添加磷反而使其過量產(chǎn)生了抑制作用，因此本試驗不添加磷酸二氫鉀。

2.2.5 硫酸鎂不同添加量對菌體生物量的影響[15]

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20mL/100mL，30℃、4%接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量為0.5%，考察硫酸鎂添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）對菌體生物量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 硫酸鎂不同添加量對菌體生物量的影響Fig.6 Effect of magnesium sulfate addition on cell biomass

由圖6可知，0.05%的硫酸鎂添加量與對照組相比對菌體生物量有促進作用，隨著添加量的增加呈現(xiàn)出抑制作用，因此硫酸鎂的添加量為0.05%。

2.2.6 酵母粉添加量對菌體生物量的影響

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20mL/100mL，30℃、4%接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量為0.5%，硫酸鎂添加量為0.05%，考察酵母粉添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）對菌體生物量的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 酵母粉不同添加量對菌體生物量的影響Fig.7 Effect of yeast extract powder addition on cell biomass

由圖7可知，隨著酵母粉添加量的增加，菌體生物量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，經(jīng)單因素方差分析0.1%組與對照之間差異不顯著（P>0.05），因此酵母粉的添加量選為0.10%。2.2.7滲透壓保護劑（甘氨酸）添加量對菌體生物量的影響

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20mL/100mL，30℃、4%接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量為0.5%，硫酸鎂添加量為0.05%，酵母粉添加量0.1%，考察甘氨酸添加量（0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%）對菌體生物量的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 甘氨酸不同添加量對菌體生物量的影響Fig.8 Effect of glycine addition on cell biomass

由圖8可知，添加0.05%的甘氨酸對菌體生物量略有增加，其余幾組隨著甘氨酸添加量的增加，菌體生物量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，因此培養(yǎng)基中添加0.05%的甘氨酸。

2.2.8 紅糖添加量對菌體生物量的影響

培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)基裝液量20mL/100mL，30℃、4%接種量、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，糖蜜含量10%、尿素添加量為0.50%，硫酸鎂添加量為0.05%，酵母粉添加量0.10%，甘氨酸添加量0.05%，考察紅糖2%、4%、6%、8%、10%添加量對菌體生物量的影響，結(jié)果見圖9。

圖9 紅糖不同添加量對菌體生物量的影響Fig.9 Effect of brown sugar addition on cell biomass

由圖9可知，隨著紅糖添加量的增加，菌體的吸光度值也隨之增加，并且經(jīng)方差分析，8%和10%兩組差異不顯著（P>0.05），其余各組間均差異顯著（P<0.05），因此紅糖的添加量選為8%。

2.3 培養(yǎng)基條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對菌體生物量提高影響較大的糖蜜、紅糖、尿素、酵母粉4個因素L9（34）進行正交試驗，因素與水平見表1，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表1 培養(yǎng)基條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for culture conditions optimization

表2 培養(yǎng)基條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for culture conditions optimization

由表2可知，RC＞RA＞RD＞RB，即尿素對菌體生物量的影響最為顯著，然后依次為糖蜜、酵母粉、紅糖。最佳發(fā)酵條件組合為A2B3C2D3，即10%糖蜜總糖含量，10%紅糖，0.50%尿素，0.50%酵母粉。以此培養(yǎng)基成分進行驗證試驗，3次重復試驗結(jié)果表明，該組合確為該株菌的最適培養(yǎng)基，在此優(yōu)化條件下培養(yǎng)菌體，酵母菌體干質(zhì)量可達到16.83 g/L。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表3方差分析結(jié)果可知，在試驗設定的范圍內(nèi)紅糖添加量對菌體生物量的影響差異不顯著，而糖蜜總糖含量、尿素含量和酵母粉含量對菌體生物量有顯著影響。

3 結(jié)論

酵母菌是一類單細胞微生物，具有個體大、易分離、易培養(yǎng)、蛋白質(zhì)含量高、代謝產(chǎn)物多等特點，在蛋白飼料嚴重不足的今天，酵母及其培養(yǎng)物的廣泛應用，對我國畜牧、飼料生產(chǎn)有重大意義。本研究對供試菌株進行了培養(yǎng)基配方的研究，經(jīng)單因素和正交試驗篩選得到的培養(yǎng)基組成為總糖含量為10%糖蜜、10%紅糖、0.50%尿素、0.50%酵母粉、0.05%硫酸鎂、0.05%甘氨酸。在此條件下菌體干質(zhì)量可以達到16.83 g/L。

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Aerobic fermentation culture medium ofSaccharomyces cerevisiae

ZHAO Xiaoli1,2,ZHEN Yuguo1,2*,WANG Lanhui1,YI Xiaofei1

(1.JAU-Borui Dairy Science and Technology R&D Center,Changchun 130118,China;

2.Technology Center of Changchun Borui Feed Group Co.,Ltd.,Changchun 130114,China)

Yeast strain selected in lab was used as testing strain and beet molasses was used as carbon source to produce yeast.Single factor and orthogonal experiment was used to optimize laboratoryshaking flask fermentation medium formula,and the optimized condition was as follows:10%molasses of total sugar content,10%brown sugar,0.50%urea,0.50%yeast powder,0.05%MgSO4and 0.05%glycine.Under this condition,the dry cell weight reached 16.83 g/L.

beet molasses;yeast;culture medium

Q93-33

A

0254-5071（2014）07-0043-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.009

2014-06-07

吉林省重大科技攻關(guān)項目（2012ZDGG006）

趙小麗（1981-），女，碩士，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料。

*通訊作者：甄玉國（1970-），男，副教授，博士，研究方向為動物營養(yǎng)。