響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉產(chǎn)孢工藝條件

張義偉，劉瑞勇，李新銳，劉旭博，張良*（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110866）

響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉產(chǎn)孢工藝條件

張義偉，劉瑞勇，李新銳，劉旭博，張良*
（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110866）

米曲霉（Aspergillus oryzae）是一種在食品中應(yīng)用廣泛的真菌。為了得到較多的米曲霉孢子，基于單因素試驗(yàn)選取了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基含水量和接種量3個因素，利用Design-Expert響應(yīng)面分析法對產(chǎn)孢進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在培養(yǎng)溫度為22.66℃，培養(yǎng)基含水量為48.79%，接種量為3.44‰時，產(chǎn)孢子數(shù)預(yù)測可達(dá)到12.743 7×109CFU/g，實(shí)際測得為12.1×109CFU/g，達(dá)到預(yù)測值的94.95%。

米曲霉；孢子粉；響應(yīng)面優(yōu)化

米曲霉（Aspergillus oryzae）是一種好氣性真菌，屬于半知菌亞門、曲霉屬。菌絲一般在酸度較大的培養(yǎng)基上呈綠色，在酸度較小的培養(yǎng)基上呈黃色，老化后逐漸為褐色[1]。其分生孢子梗生長在厚壁的足細(xì)胞上，產(chǎn)生的分生孢子頭呈放射形，頂囊球形或瓶形。米曲霉具有豐富的蛋白酶系，能產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白酶，它的穩(wěn)定性很高，可以耐受高溫，主要存在于糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物、土壤等處。米曲霉也是美國食品與藥物管理局和美國飼料公司協(xié)會1989年公布的40余種安全微生物菌種之一[2]。

目前，在醬及醬油的工業(yè)化生產(chǎn)中普遍使用米曲霉作為發(fā)酵菌株[3]。在發(fā)酵制醬的過程中，米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶系可以將含有豐富蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵等營養(yǎng)物質(zhì)的大豆[4-5]酶解，促使豆中的磷、鈣等礦物質(zhì)被釋放出來，提高人對大豆中礦物質(zhì)的吸收率，制得的大醬營養(yǎng)比大豆更易于消化吸收[6-7]，具有良好的抗血栓、抗氧化、抗病勞、抗癌等生理作用[8-9]。且若利用米曲霉孢子粉[10]代替?zhèn)鹘y(tǒng)的自然發(fā)酵中產(chǎn)生的微生物還可彌補(bǔ)傳統(tǒng)大醬釀造方法周期長的不足。

因此，高效生產(chǎn)米曲霉孢子粉具有工業(yè)價值，可以為尋找周期短、成本低、產(chǎn)量大的產(chǎn)孢條件提供依據(jù)，增強(qiáng)工業(yè)競爭實(shí)力。本研究選取了培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基含水量和接種量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再利用基于統(tǒng)計學(xué)方法[11]的Design-Expert響應(yīng)面法[12-15]對米曲霉產(chǎn)孢條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了米曲霉產(chǎn)孢子的最佳工藝條件。為快速發(fā)酵產(chǎn)孢子生產(chǎn)提供了新思路，將為米曲霉研究的發(fā)展提供理論及技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

米曲霉滬釀3.042：武漢佳成生物制品有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

麩皮、稻殼、玉米粉：均購自于市場，培養(yǎng)基中麩皮∶稻殼∶玉米粉=6∶1∶1.2。

1.1.3 試劑

無水乙醇（分析純）、硫酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JK-HI-9012恒溫培養(yǎng)箱、JK-PSPS-18L高壓蒸汽滅菌鍋：上海精科儀器公司；FA2004A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；GH-HZT電子天平：上海貴虎實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；XB.K.25血球計數(shù)板：上海市求精生化試劑儀器有限公司；XSP-8CA顯微鏡：上海上光新光學(xué)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米曲霉孢子粉的制備

按麩皮∶稻殼∶玉米粉=6∶1∶1.2的比例進(jìn)行培養(yǎng)基的配制[16]。放入高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min，冷卻至室溫后進(jìn)行米曲霉孢子粉的培養(yǎng)[17-18]。分成四大組：第一組以培養(yǎng)時間為自變量，加水量均為培養(yǎng)基總質(zhì)量的55%，接種量均為總質(zhì)量的3‰，培養(yǎng)溫度均為20℃，每天觀測產(chǎn)孢子的數(shù)量，直至第9天為止；第二組以培養(yǎng)溫度為自變量，分別取20℃、21℃、21.5℃、22℃、22.5℃、23℃、23.5℃共7個溫度梯度，其他條件均相同，培養(yǎng)5 d觀測產(chǎn)孢子數(shù)；第三組以培養(yǎng)基含水量為自變量，選取培養(yǎng)基總量的45%～70%間6個含水量梯度進(jìn)行試驗(yàn)，每個梯度相差5%，孢子粉接種量均為總質(zhì)量的3‰，培養(yǎng)溫度為20℃，5 d后觀察產(chǎn)孢情況；第四組以接種量為自變量（1.5‰、2.0‰、2.5‰、3.0‰、3.5‰、4.0‰），培養(yǎng)溫度20℃，含水量50%，培養(yǎng)5 d后計算產(chǎn)生孢子數(shù)量。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

分別以培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)基接種量為單因素變量，以產(chǎn)孢量為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3 產(chǎn)孢條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基含水量、接種量為自變量設(shè)定試驗(yàn)的因素和水平值見表1，以產(chǎn)孢量為響應(yīng)值，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理[19-21]設(shè)計響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3.4 產(chǎn)孢量的測定

（1）不同稀釋度的孢子懸浮液制備

精確稱取培養(yǎng)基（樣品）0.100 0 g，倒入盛有玻璃珠的250 mL錐形瓶內(nèi)，加體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精5 mL，加無菌水20 mL，加稀硫酸（10%）10 mL，充分振搖，使分生孢子充分分散，然后用4層紗布過濾、沖洗，使濾渣不含孢子，之后加水65 mL稀釋至100 mL，在其中取出1 mL加至9 mL水中，使孢子懸液稀釋至1 000倍。

（2）孢子數(shù)測定

取擦拭干凈的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，將稀釋的孢子懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，孢子懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余孢子懸液。靜置數(shù)分鐘，待孢子沉降。

（3）孢子數(shù)計算

采用ZBX66028—87《孢子數(shù)測定法》[22]計算孢子數(shù)。使用血球計數(shù)板，選四角及中間共5大格為計數(shù)區(qū)，得到的孢子數(shù)值為n，孢子數(shù)計算公式如下：

式中：n為血球計數(shù)板中5個大格中的總孢子數(shù)，個；G為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)時間對產(chǎn)孢的影響

培養(yǎng)時間是影響產(chǎn)孢量的重要因素之一。培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基含水量培養(yǎng)基接種量均相同，培養(yǎng)時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d，得到如圖1所示產(chǎn)孢曲線。由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，米曲霉的菌絲逐漸生成增多，培養(yǎng)基營養(yǎng)被逐漸利用，米曲霉的孢子數(shù)也在逐漸增加；培養(yǎng)至6 d左右，由于菌絲生長量一定，產(chǎn)孢量也趨于穩(wěn)定。繼續(xù)延長時間菌絲生長量不再增加，產(chǎn)孢量也不再有明顯增加。因此，培養(yǎng)時間選擇為6 d。

圖1 培養(yǎng)時間對產(chǎn)孢量的影響Fig.1 Effect of fermentation time onA.oryzaespores production

2.1.2 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)孢的影響

培養(yǎng)溫度會影響米曲霉菌絲的生長繁殖，從而會影響最終的產(chǎn)孢量。要得到大量的米曲霉孢子粉，控制合適的培養(yǎng)溫度非常重要。分別在20℃、21℃、21.5℃、22℃、22.5℃、23℃、23.5℃共7個溫度條件下進(jìn)行試驗(yàn)，得到的產(chǎn)孢量曲線如圖2所示。由圖2可知，培養(yǎng)溫度在20～22.5℃時，隨著溫度的升高，米曲霉菌絲生長繁殖逐漸加快，產(chǎn)孢量也逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到22.5℃時，產(chǎn)孢量達(dá)到峰值；但當(dāng)培養(yǎng)溫度＞22.5℃時，產(chǎn)孢量呈下降趨勢，原因是培養(yǎng)溫度升高對菌絲生長繁殖不利所致。故培養(yǎng)溫度選擇22.5℃比較合適。

圖2 溫度對產(chǎn)孢量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature onA.oryzae spores production

2.1.3 培養(yǎng)基含水量對產(chǎn)孢的影響

水分多少直接影響著米曲霉的產(chǎn)孢量，米曲霉利用培養(yǎng)基中的水分進(jìn)行生長繁殖，適宜的水分有利于菌絲的生長，從而提高孢子粉的產(chǎn)量。在其他條件不變，含水量分別為45%、50%、55%、60%、65%、70%的情況下得到的產(chǎn)孢曲線如圖3所示。由圖3可知，培養(yǎng)基含水量為50%時產(chǎn)孢量最多，含水量＜50%時，培養(yǎng)基中水的活度會降低，酶的活性也會減小，菌絲生長繁殖受限，從而影響最終的產(chǎn)孢量；含水量＞50%時，培養(yǎng)基濕度較大，質(zhì)地較密實(shí)，氧氣含量也少，不利于產(chǎn)孢。所以只有選擇合適的培養(yǎng)基的含水量才會得到理想的產(chǎn)孢效果，而且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)基內(nèi)水分逐漸蒸發(fā)，其條件更有利于產(chǎn)孢。所以含水量選擇50%為宜。

圖3 含水量對產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effect of medium water content onA.oryzae spores production

2.1.4 接種量對產(chǎn)孢的影響

接種量分別為1.5‰、2.0‰、2.5‰、3.0‰、3.5‰、4.0‰，對產(chǎn)孢量影響的曲線如圖4所示。由圖4可知，在接種量＜3.0‰的范圍內(nèi)，隨著接種量的增多，菌絲生長量也會逐漸增多，產(chǎn)孢量也會隨之增加；接種量在3.0‰時可得到產(chǎn)孢量的峰值；接種量＞3.0‰，菌絲的生長也會隨之增加，這時，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)條件有限，菌絲主要利用營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行其代謝活動，代謝的同時還會進(jìn)行二氧化碳的釋放，更不利于米曲霉進(jìn)行繁殖積累孢子。因此，接種量選擇3.0‰為宜。

圖4 接種量對產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effect of inoculum onA.oryzaespores production

2.2 米曲霉產(chǎn)孢最佳工藝參數(shù)的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以產(chǎn)孢量為考察指標(biāo)，選取培養(yǎng)溫度（℃）、培養(yǎng)基含水量（%）、接種量（‰）3個因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)對米曲霉產(chǎn)孢條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。采用Design-Expert統(tǒng)計軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，回歸方程的方差顯著性分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for response surface quadratic regression model

結(jié)果顯示，R2=0.987 1，說明回歸方程的擬合度較好，經(jīng)過回歸擬合后，培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基含水量（B）和接種量（C）對產(chǎn)孢量（Y）的影響回歸方程：Y=11.8+1.09A-1.48B+ 2.36C-1.15AB+1.87AC-0.3BC-3.42A2-4.1B2-3.42C2。

米曲霉產(chǎn)孢量模型極顯著（P＜0.01），其決定系數(shù)R2=0.987 1，說明本試驗(yàn)所選的因素之間存在著顯著的回歸關(guān)系，用此模型可以預(yù)測產(chǎn)孢量（Y）對培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基含水量（B）和接種量（C）3個因素的響應(yīng)值。

由表3可知，模型的一次項A、B、C極顯著，交互項AB顯著、AC極顯著、BC不顯著，二次項A2、B2、C2極顯著，因此各個具體試驗(yàn)因子與響應(yīng)值都不是簡單的線性關(guān)系。

根據(jù)上述模型進(jìn)行響應(yīng)面和等高線作圖，培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基含水量（B）和接種量（C）與產(chǎn)孢量之間的關(guān)系見圖5。由圖5可知，培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基含水量（B）和接種量（C）存在極值點(diǎn)，在此條件下測得的產(chǎn)孢量達(dá)到12.1×109CFU/g，與預(yù)測值（12.743 7×109CFU/g）十分接近，表明預(yù)測值和實(shí)際值有很好的擬合性，驗(yàn)證了模型的可靠性。由Design-Expert響應(yīng)面分析軟件RSM分析得到米曲霉產(chǎn)孢最佳條件是培養(yǎng)溫度為22.66℃、培養(yǎng)基含水量為48.79%、孢子粉接種量為3.44‰。在這種情況下培養(yǎng)基所得孢子數(shù)預(yù)測可達(dá)到12.743 7×109CFU/g。本試驗(yàn)對實(shí)際生產(chǎn)控制條件綜合對比得到最佳產(chǎn)孢條件為培養(yǎng)溫度為23℃、培養(yǎng)基含水量為50%、接種量為3.5‰。

圖5 各因素交互作用對米曲霉產(chǎn)孢量的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour line of interaction among each factors onA.oryzaespores production

3 結(jié)論

響應(yīng)面方法是優(yōu)化米曲霉產(chǎn)孢條件的有效工具，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計能建立主要因素影響米曲霉產(chǎn)孢的二次多項數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計學(xué)方法對該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，優(yōu)化了內(nèi)在因素水平，可以找出最佳值。經(jīng)過優(yōu)化后，在培養(yǎng)溫度為22.66℃、培養(yǎng)基含水量為48.7%、接種量為3.44‰時，產(chǎn)孢量預(yù)測可達(dá)到12.743 7×109CFU/g，實(shí)際測得為12.1×109CFU/g，達(dá)到預(yù)測值的94.95%。

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Optimization ofAspergillus oryzaespores-producing process condition by response surface analysis

ZHANG Yiwei,LIU Ruiyong,LI Xinrui,LIU Xubo,ZHANG Liang*

(College of Biological Science&Technology,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Aspergillus oryzaeis widely used in food.In order to get more spores ofA.oryzae,based on single factor test,three factors of culture temperature,medium water content and inoculums were selected to conduct response surface analysis to optimize spores production fromA.oryzae.The results showed that under the condition of temperature 22.66℃,medium water content 48.79%,inoculum 3.44‰,the predicted spores were up to 12.743 7×109CFU/g,and the actual detected number was 12.1×109CFU/g,reaching 94.95%of the predicted value.

Aspergillus oryzae;spores;response surface optimization

Q815

A

0254-5071（2014）07-0034-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.007

2014-05-09

國家科技部“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD31B05-3）；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項目（201310157539）

張義偉（1989-），女，本科生，研究方向?yàn)槲⑸锱c酶工程。

*通訊作者：張良（1979-），男，講師，博士，研究方向?yàn)樯锕こ獭?/p>