乳鐵蛋白對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)病理的抑制作用

許昱琛 桑子玚 閻思伯 郭 闖

東北大學生命科學與健康學院，遼寧 沈陽 110169

β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)為主要組成的神經(jīng)斑形成和積聚，是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的主要病理特征[1-2]。實際上，適宜濃度的Aβ對維持大腦的抗炎、血腦屏障、損傷修復以及突觸功能等生理功能是有幫助的，但Aβ累積過多則對神經(jīng)元產(chǎn)生毒害作用[3]。沉積在線粒體膜上的Aβ可打破線粒體膜電位平衡，導致電子傳遞鏈氧化磷酸化障礙、ROS大量產(chǎn)生，引起氧化應激反應，破壞其正常結構和功能，最終引起神經(jīng)細胞凋亡[4]。而氧化應激所產(chǎn)生的羥基壬烯酸又能刺激Aβ產(chǎn)生，進一步加速AD的發(fā)展[5]。另外，鐵等過渡金屬離子的存在，也促進了AD腦內(nèi)的氧化過程[6]。由于血腦屏障的存在，致使具備抗氧化作用的物質(zhì)難以進入腦部，限制了腦內(nèi)抗氧化作用物質(zhì)的補充[7]。

乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)是最早從牛乳中分離獲得、具有多種生理學功能的一種非血紅素鐵結合糖蛋白。Lf不僅參與金屬離子代謝，也與一系列的炎癥反應及氧化等生理活動有關，并易于透過血腦屏障[8]。基于AD患者腦內(nèi)Lf的表達量高于正常人，推測Lf可能具有阻抑AD病理進程的作用，并在AD動物模型中得以證實[9]。本研究將進一步探討Lf阻抑APP/PS1小鼠神經(jīng)病理、發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制，以期為將外源補充Lf應用于AD的臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1實驗動物APP/PS1(APPswe/PSEN1dE9)轉(zhuǎn)基因小鼠始購于美國Jackson實驗室，該小鼠在6個月齡左右腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑，是AD研究的常用模式生物。IVC籠具常規(guī)飼養(yǎng)，繁殖。子代進行PCR基因型鑒定，陽性的雄性小鼠用于實驗。

1．2主要試劑及儀器試劑：人源乳鐵蛋白Lf(Sigma，L4040)，RIPA強裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(康為世紀生物有限公司)，標準蛋白(上海碧云天生物技術有限公司)，PVDF膜和蛋白marker(Thermo公司)，Protease Inhibitor Cocktail(康為世紀生物有限公司)，ECL發(fā)光液(Tanon公司)，尼氏染液(上海碧云天生物技術有限公司)；第一抗體：鼠源Aβ抗體購于Sigma公司，兔源GFAP(星形膠質(zhì)細胞標記物)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX4)抗體購于Santa Cruz公司，兔源Iba-1(小膠質(zhì)細胞標記物)抗體購于Wako公司，兔源線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，兔源NeuN(神經(jīng)元標記物)和鼠源β-actin抗體以及熒光二抗(羊抗鼠/兔Alexa488和FITC)購于Cell Signaling Technology公司。

儀器：德國Leica公司的激光共聚焦顯微鏡、正置顯微鏡圖像分析系統(tǒng)、冰凍切片機和石蠟切片機，美國 Bio-Rad公司的化學發(fā)光成像系統(tǒng)，美國Beckman公司的高速低溫冷凍離心機，上海天能科技有限公司的電泳凝膠分析儀、電泳儀及電泳槽等。

1．3動物分組及用藥取6個月齡雄性轉(zhuǎn)基因小鼠16只，體質(zhì)量25 g左右，隨機分為對照組和Lf組。其中Lf組隔日鼻腔給予Lf溶液，使給藥濃度達2 mg·kg-1，對照組給等體積的生理鹽水。3個月后按倫理學要求處死動物，取材。右半腦后固定，用于形態(tài)學觀察；左半腦-80 ℃凍存，用于分子生物學研究。

1．4實驗方法

1．4．1 免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察：用4%多聚甲醛后固定的腦組織，放入30%的蔗糖溶液中，沉糖48 h。冰凍切片機切10 μm厚切片，自然風干后，取不同組位置一致的切片若干張放入ddH2O洗3次，5 min/次，山羊血清封閉液封閉1 h，滴加一抗稀釋液(含TritonX-100)配制的兩種不同來源的抗體，4 ℃孵育過夜，隔日，復溫后，0.01 mol/L PBS漂洗，滴加PBS稀釋的熒光二抗(1∶500)室溫避光孵育2 h，PBS洗，DAPI染色5 min，防淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。

1．4．2 尼氏染色：將5 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。用移液器在組織上滴加適量Nissl染液，染色8 min，然后用ddH2O洗滌2次，30 s/次。再將切片進行脫水、透明，分別于95%乙醇I、95%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2、2、5、5 min，最后滴加中性樹膠、用蓋玻片封片。待自然風干后在光學顯微鏡觀察拍照。

1．4．3 Westernblot檢測：稱取小鼠的皮層或海馬組織，加入含PMSF的RIPA裂解液，用超聲破碎儀破碎組織，用4 ℃離心機以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，收集上清，提取其總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后，放入-20 ℃冰箱保存，待用。取含等量總蛋白的樣品，用10%濃度的SDS-PAGE膠進行電泳，分離蛋白，然后將其轉(zhuǎn)印到甲醇活化的PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，借助蛋白marker的標記將PVDF膜裁剪為條帶，分別加入5%脫脂牛奶稀釋的一抗，在4 ℃冰箱搖床上孵育過夜。次日，從一抗中取出條帶，用TBST漂洗3次，將條帶放入用TBST稀釋的辣根過氧化物酶-山羊抗鼠或兔第二抗體(1∶5 000，Santa Cruz)，孵育2 h。TBST洗去殘存二抗，將ECL發(fā)光液均勻滴加在裁好的PVDF膜上，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)發(fā)光拍照。

2 結果

2．1Lf抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ誘發(fā)的星形膠質(zhì)細胞活化GFAP是星形膠質(zhì)細胞的標志性蛋白。免疫熒光顯示(圖1)，GFAP染色(綠色)陽性的星形膠質(zhì)細胞，在Aβ染色(紅色)陽性的神經(jīng)斑周邊密集分布。與對照組相比，Lf處理組的星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量減少，且胞體變小、粗大的突起回縮，表明Aβ誘發(fā)的星形膠質(zhì)細胞活化受到了抑制。

2．2Lf對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的影響通過Aβ(紅色)與小膠質(zhì)細胞標記蛋白Iba1(綠色)進行免疫熒光雙標，檢測小膠質(zhì)細胞在APP/PS1小鼠腦內(nèi)的分布情況。如圖2所示，小膠質(zhì)細胞主要集聚在Aβ陽性斑周圍。與對照組相比，鼻腔給予hLf并未明顯減少小膠質(zhì)細胞的數(shù)目，但小膠質(zhì)細胞的突起變少，胞體變圓。

2．3Lf上調(diào)GPX4和TFAM的表達為了探討鼻腔給予Lf是否在APP/PS1小鼠腦內(nèi)發(fā)揮抗氧化功能，我們用Western blot檢測了GPX4和TFAM蛋白的表達情況。如圖3所示，相較于對照組，Lf組小鼠腦內(nèi)的GPX4和TFAM蛋白的表達均顯著增高。

2．4Lf改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元的功能尼氏染色(圖3A)顯示，與對照組相比，Lf組APP/PS1小鼠神經(jīng)元的尼氏染色強度明顯增強，尤其在海馬CA3區(qū)的神經(jīng)元更明顯。進一步用Western blot檢測神經(jīng)元的標記蛋白NeuN的表達情況，結果證實Lf組APP/PS1小鼠腦內(nèi)的NeuN蛋白含量亦明顯上調(diào)，表明神經(jīng)元的功能受到保護。

圖1 Aβ和星形膠質(zhì)細胞在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的分布觀察Figure 1 Distribution of Aβ and astrocytes in the brain of APP/PS1 double transgenic mice

圖2 Aβ和小膠質(zhì)細胞在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的分布觀察Figure 2 Distribution of Aβ and microglia in the brain of APP/PS1 double transgenic mice

圖3 GPX4和TFAM蛋白在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的表達變化Figure 3 Expression changes of GPX4 and TFAM proteins in the brain of APP/PS1 double transgenic mice

圖4 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的尼氏染色及腦內(nèi)NeuN蛋白的表達變化Figure 4 Nissl staining of APP/PS1 double transgenic mice and expression of NeuN protein in the brain

3 討論

目前，對AD的防治尚缺乏有效的措施，這可能與AD的發(fā)病機制復雜有關，因此，具有多作用靶點的藥物或聯(lián)合用藥引發(fā)了更多關注[10]。Lf具有的抗炎、抗氧化及螯合鐵等多種生物學功能[11]，為臨床用于AD的防治提供了可能。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1小鼠腦內(nèi)Lf的表達高于野生對照小鼠，但在老齡時含量降低[11]，提示Lf在AD病變區(qū)的表達可能與抑制其神經(jīng)病理有關。這在我們前期的研究中得到證實，鼻腔給予Lf能夠調(diào)節(jié)APP向非淀粉樣途徑代謝，從而減少Aβ的產(chǎn)生，并改善APP/PS1小鼠的認知下降[9]。本實驗中，首先驗證Lf的抗炎效果[12]，通過免疫熒光雙標激光共聚焦技術發(fā)現(xiàn)，9月齡AD模型小鼠明顯激活的星形膠質(zhì)細胞，在給予Lf后數(shù)量減少且突起回縮，呈低活性狀態(tài)，鼻腔給予APP/PS1小鼠Lf能夠顯著抑制星形膠質(zhì)細胞活性。但并未發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著減少，而其形態(tài)變化呈現(xiàn)吞噬作用狀態(tài)。實際上，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫細胞作用的主要細胞，目前認為小膠質(zhì)細胞可能通過兩種機制在AD的發(fā)病機制中起作用。一方面，隨著AD的特征性病理改變，小膠質(zhì)細胞也隨之活化進而引起局部的炎癥反應；另一方面，其可以起到清除Aβ的作用[13-14]。本實驗中，我們推測因為Lf減少了Aβ的產(chǎn)生，使其病理進展延緩，因而小膠質(zhì)細胞發(fā)揮吞噬作用為主。

Lf已被證實具有螯合鐵離子的作用[15]，而細胞內(nèi)鐵沉積被認為是誘導氧化應激產(chǎn)生及對神經(jīng)元毒害的重要原因[16-17]。GPX4是一種多功能的硒蛋白，廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，是人體參與抗氧化作用的一類重要蛋白，能保護生物膜系統(tǒng)免受氧化，同時也在細胞凋亡等方面有著重要作用[18]。TFAM是一種DNA結合蛋白，可以調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄復制，同時也參與氧化磷酸化產(chǎn)生能力的過程，而且在發(fā)生氧化應激時，可對線粒體發(fā)揮保護作用，抑制細胞凋亡[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)鼻飼Lf能提高小鼠腦中GPX4和TFAM等蛋白的表達，這些結果提示外源Lf可通過螯合鐵并上調(diào)抗氧化酶系統(tǒng)的表達發(fā)揮抗氧化作用[21-22]。重要的是，具有促進神經(jīng)元再生增強神經(jīng)元抗損傷與凋亡能力的神經(jīng)元特異核蛋白NeuN[23]也在Lf處理后上調(diào)，并且通過尼氏染色發(fā)現(xiàn)給Lf組APP/PS1小鼠腦內(nèi)以CA3區(qū)為代表的神經(jīng)元胞體內(nèi)尼氏體呈現(xiàn)增多的趨勢，而尼氏體的主要作用是合成用于更新細胞器的結構蛋白，合成神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶類以及肽類的神經(jīng)調(diào)質(zhì)[24]。尼氏體大而多反映神經(jīng)細胞合成蛋白質(zhì)的功能較強，在神經(jīng)元受損時，尼氏體數(shù)量減少甚至消失[25]。

本研究證實，鼻腔給予APP/PS1小鼠2 mg/Kg的Lf，除通過調(diào)節(jié)APP向非淀粉樣途徑代謝，減少Aβ的產(chǎn)生之外[9]，也可通過抑制神經(jīng)炎癥、抗氧化、改善線粒體功能等多靶點、多途徑保護神經(jīng)元免受Aβ和游離鐵離子的毒性損傷，也為選用Lf用于AD的臨床防治提供了一定的理論依據(jù)。