逆流色譜技術(shù)在手性分離方面的應(yīng)用

呂迎春，樊竹青

（普洱學(xué)院，生命科學(xué)系，云南 普洱 665000）

逆流色譜技術(shù)在手性分離方面的應(yīng)用

呂迎春，樊竹青

（普洱學(xué)院，生命科學(xué)系，云南 普洱 665000）

逆流色譜是一種不用固態(tài)支撐體或載體的液液分配色譜技術(shù)，其分離原理具有手性制備性分離的優(yōu)勢(shì)。以近年采用逆流色譜技術(shù)對(duì)手性化合物分離的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

逆流色譜；手性化合物；手性分離；手性選擇劑

手性化合物尤其是手性藥物對(duì)映體的手性分離在藥物研究和制藥工業(yè)方面具有重要的意義，根據(jù)手性藥物和藥效關(guān)系表明，手性藥物進(jìn)人體后，其藥理作用是通過(guò)與體內(nèi)靶分子之間的嚴(yán)格手性匹配和分子識(shí)別能力而實(shí)現(xiàn)的［1］。因此盡管具有手性中心的外消旋體間有著極其相近的理化性質(zhì)，但其藥理和毒副作用卻可能存在著差異。手性藥物對(duì)映體間的藥理活性差異主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①對(duì)映體有相同但程度有差異的活性；②一種對(duì)映體具有顯著的活性但其對(duì)映體活性很低或無(wú)此活性甚至具有毒副作用；③對(duì)映體的藥理活性相反；④對(duì)映體的藥理活性互補(bǔ)；⑤對(duì)映體的藥理活性不同。例如氧氟沙星（Ofloxacin）是第三代氟喹諾酮類廣譜抗菌藥，近年來(lái)研究證明左旋氧氟沙星抗革蘭氏陽(yáng)性菌及陰性菌的活性是右旋的8～128倍，是氧氟沙星外消旋體的2倍［2］；而左旋氧氟沙星用于治療艾滋病毒引起的感染，其作用是外消旋體的2倍，右旋體卻無(wú)此藥理活性［3］。沙利度胺（反應(yīng)停）的兩個(gè)對(duì)映體中只有（R）－（＋）對(duì)映體作為鎮(zhèn)靜劑，用于緩解妊娠反應(yīng)，而（S）－（－）對(duì)映體則具有強(qiáng)的致畸作用。

1992年，美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）已明確規(guī)定對(duì)于新藥必須分別給出外消旋藥物左旋體和右旋體的藥效及藥動(dòng)學(xué)的有關(guān)資料。近年來(lái)，單一手性藥物的銷量呈連續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，2000年達(dá)到1300億元，2010年超過(guò)2500億元。全球最暢銷的500種藥中，單一手性藥物已經(jīng)達(dá)到了270種以上。手性藥物的開(kāi)發(fā)正成為國(guó)內(nèi)外藥物研究、開(kāi)發(fā)和銷售的熱點(diǎn)。美國(guó)、法國(guó)和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家的一些藥物生產(chǎn)廠家已把高效生產(chǎn)光學(xué)純藥物制品作為市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的法寶。隨著藥物研究的逐漸深入，如何獲得單一對(duì)映體藥物成為了當(dāng)前國(guó)際熱門(mén)的研究方向［4］。

天然活性物質(zhì)數(shù)量、種類十分有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了人類對(duì)單一手性化合物的需求。從近年研究看主要獲得單一手性化合物的方法有三種：①手性源合成法：以手性源為原料合成其他手性化合物。②不對(duì)稱合成法：是在催化劑或酶的作用下合成得到單一對(duì)映體化合物的方法。③外消旋體拆分法：是在手性選擇劑作用下將外消旋體拆分成兩個(gè)對(duì)映體，這種方法在工業(yè)生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約65%的非天然手性藥物是由外消旋體或中間產(chǎn)物的拆分獲得的［5］。

1 逆流色譜在手性分離中的發(fā)展過(guò)程

逆流色譜是一種不用固態(tài)支撐體或載體的液液分配色譜技術(shù)，它具有兩大優(yōu)點(diǎn)：分離柱中的固定相不需要載體，消除了液固色譜由于使用載體而帶來(lái)的吸附現(xiàn)象，特別適合于分離極性物質(zhì)和具有生物活性的物質(zhì)；特有的分離方式尤其適合于制備性分離，每次進(jìn)樣量及進(jìn)樣體積較大，同時(shí)具有高樣品回收率。自1966年自第一臺(tái)逆流色譜（Counter Current Chromatography，簡(jiǎn)稱CCC）儀器問(wèn)世以來(lái)，到目前為止，發(fā)展比較完善且具有實(shí)用意義的當(dāng)屬高速逆流色譜［6］（High－speed Counter Current Chromatography，簡(jiǎn)稱HSCCC）。

HSCCC是早在20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種液－液分配色譜分離技術(shù)，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院Ito博士研制開(kāi)發(fā)而成，其分離柱是聚四氟乙烯管繞成的螺旋柱，主要是建立在一種特殊的流體動(dòng)力學(xué)平衡基礎(chǔ)上，利用螺旋管的高速行星式運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的不對(duì)稱離心力場(chǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)高效的分離和制備，并且可以達(dá)到幾千個(gè)理論塔板數(shù)［7］。HSCCC儀器價(jià)格便宜，操作方便，分離柱中沒(méi)有載體存在，在互不相溶的兩相（固定相及流動(dòng)相）中可方便地在任一相中添加手性分離材料，當(dāng)其添加到固定相中相當(dāng)于手性柱液相色譜，添加到流動(dòng)相中相當(dāng)于在流動(dòng)相中含有手性添加劑的液相色譜；甚至可在同一相中添加兩種甚至多種手性分離材料，以實(shí)現(xiàn)手性制備性分離的要求。盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，但CCC在手性分離中的應(yīng)用還很少，究其原因主要在于CCC分離柱的分離效率較低，通常，手性選擇劑對(duì)對(duì)映體的分離因子需要大于1.4才能實(shí)現(xiàn)在CCC的成功拆分［8］，而大多數(shù)情況下對(duì)映體之間的分離因子都很小，要實(shí)現(xiàn)對(duì)映體之間的CCC手性拆分相對(duì)來(lái)講就比較困難，因此找到具有高選擇性的手性選擇劑和合適的兩相溶劑系統(tǒng)對(duì)實(shí)現(xiàn)手性拆分是十分重要的。

液相色譜中的手性識(shí)別作用通常是采用“三點(diǎn)作用”模式進(jìn)行解釋。對(duì)于建立在單向性流體動(dòng)力平衡體系的CCC的手性分離，一般是把手性選擇劑添加到固定相中，利用CCC分離手性化合物常常選擇一種手性選擇劑（Chiral Selector，簡(jiǎn)稱CS）并使其溶解于固定相中，通過(guò)該對(duì)對(duì)映體與CS在互不相溶的兩相溶劑系統(tǒng)中具有不同的分配系數(shù)將其分離開(kāi)來(lái)。

近年來(lái)環(huán)糊精、冠醚、大環(huán)抗生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、低聚糖和高聚糖、膽汁酸、金屬離子配合物等已被用于手性分離研究中，但目前已報(bào)道用于CCC手性分離的非常有限，僅有為數(shù)不多的幾種。

隨著高效手性選擇劑的發(fā)現(xiàn)和逆流色譜儀器的進(jìn)一步更新完善，近年來(lái)逆流色譜在手性分離方面取得了一些成功應(yīng)用。早在1982年由Hostettmann等［14］首先使用（R，R）－酒石酸－二－5壬基酯作為手性選擇劑，在六氟磷酸鹽存在時(shí)使用旋轉(zhuǎn)小室逆流色譜拆分了（＋）－去甲麻黃堿。雖然沒(méi)有達(dá)到基線分離，但這次研究向人們展示了利用逆流色譜對(duì)外消旋體實(shí)現(xiàn)分離的良好潛力。

2 逆流色譜的主要手性選擇劑

2.1 L－脯氨酸衍生物

1979年，Pirkle等人首次將L－脯氨酸鍵合于硅膠上作為一種手性固定相，之后L－脯氨酸衍生物被廣泛用于HPLC手性固定相研究。L－脯氨酸衍生物易對(duì)具有相似電荷特征的手性化合物進(jìn)行拆分，因此成為了在逆流色譜中較早使用的手性添加劑。

1984年Takeuchi等從Davanoove等合成N－正十二烷基脯氨酸受到啟發(fā)，將其作為當(dāng)時(shí)流行的液滴逆流色譜的手性添加劑，對(duì)異亮氨酸對(duì)映異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)了基線分離，同時(shí)部分分離了（±）纈氨酸和（±）蛋氨酸。在逆流色譜中使用L－脯氨酸衍生物作為手性添加劑的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道見(jiàn)表1。

表1 L－脯氨酸衍生物作為手性添加劑分離手性化合物Table 1 L－proline derivatives as chiral additives to separate chiral compounds

2.2 β－環(huán)糊精衍生物

一分子β－環(huán)糊精（β－Cyclodextrin，β－CD）是由7個(gè)葡萄糖單元通過(guò)α－（1，4）苷鍵連接構(gòu)成的環(huán)狀低聚糖。每個(gè)葡萄糖分子有5個(gè)手性碳原子，故一分子β－CD具有35個(gè)手性碳原子。分子中具有中環(huán)并呈“V”型的圓筒狀結(jié)構(gòu)，它具有一定尺寸的疏水性空腔和親水性外沿，對(duì)其外沿的基團(tuán)進(jìn)行取代，可得一系列衍生物，能作為“宿主”包絡(luò)“客體”形成特殊結(jié)構(gòu)的包合物。因此具有一定的立體選擇和識(shí)別性能。在逆流色譜中使用β－CD衍生物作為手性添加劑的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道見(jiàn)表2。

表2 β－CD衍生物作為手性添加劑分離手性化合物Table 2 β－CD derivatives as a chiral additive to isolated chiral compounds

2.3 金雞納堿衍生物

Lindner［20］等發(fā)現(xiàn)從金雞納樹(shù)皮中提取的奎寧（QN）和奎寧定（QD）可作為一種選擇性很強(qiáng)的交換型手性添加劑。對(duì)其進(jìn)行衍生化時(shí)，引入一個(gè)大取代基金剛烷基團(tuán)，可生成選擇性更強(qiáng)的手性添加劑，即金剛烷基氨基甲酰基QN－Selector 1和QN－Selector 2。它們易于接受和失去質(zhì)子，故對(duì)氨基酸的分離具有較好的選擇性，從而被應(yīng)用于色譜、毛細(xì)管電泳（CE）、萃取等手性分離中。

Franco等［21］將奎寧和奎寧定進(jìn)一步衍生化，使用逆流色譜技術(shù)在氨基乙酸緩沖溶液（pH＝6.0）／叔戊醇／甲醇／正庚烷（10∶5∶1∶5）兩相溶劑系統(tǒng)，分離了DNB－亮氨酸、N－（3，5－二硝基苯甲?；挛旎拾彼岷蚇－（3，5－二硝基苯甲?；拢奖彼?。用0.1mol／L氨基乙酸緩沖溶液（pH＝8.0）／丙酮／甲基異丁基酮（2∶1∶2）最大分離了300mg的DNB－亮氨酸。用pH區(qū)帶精制逆流色譜，最大分離了1.2g的DNB－亮氨酸。隨后Gavioli等［22］也用合成的氫化奎尼定1，4－（2，3－二氮雜萘）二醚作為手性添加劑對(duì)2－（2，4－二氯苯氧基）丙酸實(shí)現(xiàn)了手性分離。

2.4 萬(wàn)古霉素

大環(huán)抗生素作為手性選擇劑被廣泛地應(yīng)用到色譜、毛細(xì)管電泳等手性分析中。萬(wàn)古霉素易溶于水（＞140 mg／mL）、二甲基亞砜，微溶于甲醇，難溶于高級(jí)脂肪醇及弱極性溶劑。Duret等［23］應(yīng)用CCC和CPC（行星式逆流色譜）選用甲苯和水作為溶劑系統(tǒng)，使萬(wàn)古霉素在水中的質(zhì)量濃度達(dá)到140mg／mL，調(diào)整pH為4.7。采用雙相洗脫方式，耗時(shí)50 min，實(shí)現(xiàn)了對(duì)50 mg D，L－丹磺酰正亮氨酸的基線分離。

在取得了上述的分離效果的同時(shí)，研究者也發(fā)現(xiàn)萬(wàn)古霉素要作為CCC的手性選擇劑條件苛刻：首先溶劑系統(tǒng)中非芳香族化合物的加入就會(huì)降低萬(wàn)古霉素的手性選擇性，因此必須有含有芳香性溶劑所構(gòu)成的兩相溶劑系統(tǒng)以使萬(wàn)古霉素能保留在水相中，同時(shí)萬(wàn)古霉素所要求的溶劑系統(tǒng)pH范圍窄；其次為實(shí)現(xiàn)分離，萬(wàn)古霉素的濃度必須達(dá)到足夠高而其相對(duì)分子質(zhì)量又較大（Mr＝1400），因此要實(shí)現(xiàn)制備性應(yīng)用還比較困難。

2.5 酒石酸及其衍生物

D－酒石酸或L－酒石酸是一種常用的酸性手性拆分劑，酒石酸及其衍生物在重結(jié)晶、萃取中均有應(yīng)用，但用經(jīng)典拆分獲得的單體純度不高。

1982年Domon等首先使用（R，R）－酒石酸－二－5壬基酯作為手性選擇劑，在六氟磷酸鹽存在時(shí)使用旋轉(zhuǎn)小室逆流色譜部分拆分了±去甲麻黃堿。蔡瑛等［24］使用L－酒石酸作為手性拆分劑運(yùn)用高速逆流色譜成功拆分了α－苯乙胺，最大拆分量可達(dá)到120 mg。隨后申報(bào)人等用L－酒石酸嘗試對(duì)氧氟沙星（R，S－oflxacin）進(jìn)行手性分離也獲得了成功。童勝?gòu)?qiáng)等［25］基于酒石酸－硼酸絡(luò)合手性選擇劑以氯仿－水相（0.05 mol·L－1）作為溶劑系統(tǒng)對(duì)普萘洛爾、吲哚洛爾和阿普洛爾3種藥物進(jìn)行了手性分離。作者所在課題組［26］通過(guò)手性萃取拆分研究確定了高速逆流色譜拆分氧氟沙星的兩相溶劑系統(tǒng)為：乙酸乙酯：甲醇：水（10∶1∶9，v／v），固定相含有200 mmol／L的L－（＋）－酒石酸，拆分了20 mg R，S－氧氟沙星，實(shí)現(xiàn)了制備性分離的效果。

2.6 其他

此外牛血清白蛋白、纖維素和多糖、（－）－R－2－氨基丁醇、（＋）－（18－冠－6）－四羧酸等手性試劑也被應(yīng)用到CCC中。

近20～30年間CCC被廣泛用于分離天然產(chǎn)物、抗生素、蛋白質(zhì)等。國(guó)外已有5本英文專著出版，我國(guó)目前也出版了兩本中文專著。但應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行手性分離研究起步較晚，目前從作者所掌握的資料來(lái)看，這方面的文獻(xiàn)不超過(guò)30篇。

總的來(lái)說(shuō)，如何提高HSCCC技術(shù)進(jìn)行手性分離仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。逆流色譜分離手性化合物需要手性試劑具有良好的手性識(shí)別能力才能使對(duì)映體獲得完全的制備性分離。HSCCC分離柱理論塔板數(shù)相對(duì)很低，性能優(yōu)秀的手性選擇劑的缺乏，都制約著手性分離的應(yīng)用，合適的溶劑系統(tǒng)同樣是分離獲得成功必不可少的因素。從目前的研究來(lái)看從萃取、氣相、液相、毛細(xì)管電泳中廣泛應(yīng)用的手性選擇劑中，找到適合于CCC的手性添加劑是一種較好的選擇途徑。目前有研究提出如果能在逆流色譜固定相和流動(dòng)相中添加不同的手性試劑，采用雙相識(shí)別模式，如水溶性和脂溶性手性試劑的組合，這個(gè)方法若能實(shí)現(xiàn)則可能在一定程度上彌補(bǔ)逆流色譜分離效率低的缺陷。

［1］許關(guān)姐，劉玲玲.手性藥物［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2001，36：152.

［2］Hayakawa I，Atarashi S，Yokohama S，et al.Synthesis and antibacterial activities of optically active ofloxacin［J］.Antimicrob.Agents Chemother，1986，29：163－164.

［3］Goodwin S D，Gallis H A，Chow A T.Pharmacology and safety of levofloxacin in patients with human immunodeficiency virus infection.Antimicrob［J］.Antimicrob.A-gents Chemother.，1994，38：799－804.

［4］Michael J.Single enantiomer drugs：new strategies and directions［J］.Chem.Ind.，1996，5：374－378.

［5］Gimenez F，Pennie R A，Crevoisier C.Stereoselective pharmacokinetics of mefloquine in healthy caucasinans after multiple does［J］.J.Pharm.Sci.，1994，83：824－827，.

［6］袁黎明.制備色譜技術(shù)及應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工藝出版社，2005.

［7］Ito Y.New continous extraction method with a coil planet centrifuge［J］.J.Chromatogr.A，1981，207：161－169.

［8］曹學(xué)麗.高速逆流色譜分離技術(shù)及應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［9］Takeuchi T，Horikawa R，Tanimura T.Complete resolution of D，L－isoleucine by droplet counter－current chromatography［J］.J.Chromatogr.，1984，284：285－288.

［10］Oliveros L，F(xiàn).ranco P，Minguillon C，et al.Donor－acceptor chiral centrifugal partition chromatography：complete resolution of two pairs of amino－acid derivatives with a chiral II donor selector［J］.J.Liq.Chromatogr. Related Technol.，1994，17：2301－2318.

［11］Pirkle W H，Murray P G.Chiral stationaryphase design.use of intercalative effects to enhance enantioselectivity［J］.J.Chromatogr.，1993，641：11－19.

［12］Ma Y，Ito Y，F(xiàn)oucault A.Resolution of gram quantities of racemates by high speed countercurrent chromatography［J］.J.Chromatogr.A，1995，704：75－81.

［13］Ma Y，Ito Y.Chiral separation by high speed countercurrent chromatography［J］.Anal.Chem.，1995，67：3069－3074.

［14］Ma Y，Ito Y.Affinity countercurrent chromatography using a ligand in the stationary phase［J］.Anal.Chem.，1996，68：1207－1211.

［15］Ma Y，Ito Y，Berthod A.A chromatographic method for measuring KF of enantiomer－chiral selector complexes［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，1999，22：2945－2955.

［16］Delgado B，Pérez E，Satano M C，et al.Enantiomer separation by counter－current chromatography：optimisation and drawbacks in the use of L－proline derivatives as chiral selectors［J］.J.Chromatogr.A，2005，1092：36－42.

［17］Breinholt J，Lehmann S V，Varming A R.Enantiomer separation of 7－desmethylormeloxifene using sulfated beta－cyclodextrin in countercurrent chromatography［J］.Chirality，1999，11：768－771.

［18］Yuan L M，Liu J C，Yan Z H，et al.Enantioseparation of chlorpheniramine by high speed countercurrent chro-matography using carboxymethyl－β－cyclodextrin as chiral selector［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，2005，28：3057－3063.

［19］Ai P，Liu J C，Min Z，et al.Enantioseparation of Aminoglutethimide by High－speed counter－current chromatography using carboxymethly－β－cyclodextrin as chiral Selector［J］.Chin.Chem.Lett.，2006，17：787－790.

［20］Lindner W，Lammerhofer M，Maier N M.PCT／EP：1997，97／02888.

［21］Franco P，Blanc J，Oberleitner W R，et al.Enantiomer separation by countercurrent chromatography using cinchona alkaloid derivatives as chiral selectors［J］.Anal. Chem.，2002，74：4175－4183.

［22］Gavioli E，Maier NM，Minguillon C，et al.Preparative enantiomer separation of dichlorprop with a cinchonaderived dhiral selector employing centrifugal partition chromatography and high－performance liquid chromatography：A comparative study［J］.Anal.Chem.，2004，76：5837－5848.

［23］Duret P，F(xiàn)oucault A，Margraff R.Vancomycin as A chiral selector in centrifugal partition chromatography［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，2000，23：295－312.

［24］Cai Y，Yan Z H，Zi M，et al.Preparative Enantioseparation of DL－a－methylbenzylamine by high－speed countercurrent chromatography using L－（1）－tartaric acid as chiral selector［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，2007，30：1489－1495.

［25］Tong S Q，Zheng Y，Yan J，et al.Preparative enantiosepation of β－blocker drugs by counter－current chromatography using dialky L－tartrate as chiral selector based on borate coordination complex［J］.Chromatogr.2010，A，1263：74－78.

［26］Lv Y C，Yan Z H，Ma C，et al.Preparative enantioseparation of ofloxacin by high speed countercurrent chromatography using L－（＋）－tartaric acid as chiral selector［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，2010，33：1328－1334.

Application of Countercurrent Chromatography on Chiral Separation

LV Ying－chun，F(xiàn)an Zhu－qing

（The Faculty of Life Sciences，Puer College，Puer 665000，China）

Countercurrent chromatography is a liquid－liquid partition chromatography，without the use of support body or carrier.It is of advantage for chiral separation.In this paper its recent application in chiral separation is reviewed.

countercurrent chromatography；chiral compound；chiral separation；chiral selector

O658

A

1004-275X（2014）05-0044-05

12.3969／j.issn.1004-275X.2014.05.011

收稿：2014-05-14

基金項(xiàng)目：云南省教育廳科學(xué)研究基金（2013Y108）。

呂迎春（1973-），女，云南普洱人，碩士，副教授，主要從事手性分離研究。