紫莖澤蘭多糖的免疫調(diào)節(jié)活性研究

萬春燕，周緒斌

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100093；2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032)

1 紫莖澤蘭多糖的提取

取100 g陰涼處干燥的紫莖澤蘭葉片，將葉片剪碎，輾成粉，40目過濾篩過濾。再將其溶于1 000 mL蒸餾水中，于超聲波提取裝置中提取40 min，收集上清液，沉淀物再懸浮于1000 mL蒸餾水，再次通過超聲處理提取30 min，將得到的上清液與前一次所得合并，最后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將水相蒸發(fā)至干，得到的殘留物溶解在蒸餾水中，并在4℃下冷凍保存。

2 紫莖澤蘭多糖的純化制備

將萃取液在3 000 g/min離心25 min，80 ℃下進(jìn)行濃縮8 h，以制備多糖，將上清液用Sevag法脫蛋白。必要時(shí)可用紫外分光光度計(jì)測 250～280 nm沒有吸收峰方可確定除凈了蛋白。將上層清液用2 mol/L 氫氧化鈉調(diào)至pH=7，加熱回流用1%活性炭脫色。

取除雜蛋白后的溶液10 mL，裝入截留分子量為8 000～15 000的透析袋中透析脫鹽及小分子雜質(zhì)，透析液離心（3 000 r/min，10 min），上清于80 ℃水浴濃縮至原體積的1/3。然后加入4倍體積95%乙醇（v/v）沉淀24 h后，離心（3 000 r/min，15min），沉淀用無水乙醇洗滌2次，乙醚洗滌1次，真空干燥得紫莖澤蘭多糖樣品。

以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用苯酚-濃硫酸分光光度法測醇沉淀物中的EAP糖含量。

3 紫莖澤蘭多糖對(duì)人源細(xì)胞和鼠源細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

3.1 多糖的處理

1）將提取的紫莖澤蘭多糖溶于蒸餾水中，經(jīng)0.45 μm和0.22μm的過濾器過濾，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋；

2)將T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的人源（A549）細(xì)胞和鼠源（RAW264.7）細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后加入細(xì)胞培養(yǎng)液使其最終體積為20 mL，向6孔培養(yǎng)液中加入2 mL/孔，同時(shí)加入紫莖澤蘭多糖溶液200 μL/孔，使其最終濃度為50，100，200，400μg/mL，另外設(shè)脂多糖（LPS）組，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)?？瞻讓?duì)照加入200 μL相應(yīng)的磷酸緩沖（PBS）液。

3)培養(yǎng)12 h，24 h，36 h每個(gè)濃度取3個(gè)樣品，提取細(xì)胞總RNA，采用熒光定量PCR方法檢測紫莖澤蘭多糖的免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-6，TNF-α，IFN-β，IFN-γ等。

3.2 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物合成cDNA

3.3 熒光定量PCR

用β-actin作為內(nèi)參。獲得的實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT方法分析相關(guān)基因的表達(dá)。

3.4 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism V5.01作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異顯著，在圖中用“*”表示。

4 結(jié)果

4.1 紫莖澤蘭多糖對(duì)人源細(xì)胞（A549）的免疫調(diào)節(jié)作用

4.1.1 不同濃度的EAP對(duì)A549細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)選取的紫莖澤蘭多糖濃度分別為50μg/mL、100μg/mL、200 μg/mL和 400μg/mL， 分 別 作 用 于A549細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用相對(duì)熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明在200μg/mL時(shí)4種細(xì)胞因子的表達(dá)量都較高（P＜0.05）。

EAP終濃度分別為50 μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL，LPS對(duì)照的濃度為50 ng/mL，PBS組為陰性對(duì)照。從圖1中可以看出，IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ在EAP濃度為200 μg/mL時(shí)其mRNA的表達(dá)都顯著提高（P＜0.05）。EAP濃度200μg/mL與其他濃度相比提高效果最明顯。

4.1.2 不同時(shí)間點(diǎn)EAP對(duì)A549細(xì)胞的影響

圖1 采用相對(duì)熒光定量PCR方法測定不同濃度的EAP對(duì)A549細(xì)胞因子表達(dá)的影響

圖2 采用相對(duì)熒光定量PCR方法測定不同時(shí)間點(diǎn)EAP對(duì)A549細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)選取了紫莖澤蘭多糖濃度為200 μg/mL，分別作用時(shí)間12 h、24 h和36 h于A549細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用相對(duì)熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明EAP濃度200 μg/mL作用36 h，IL-6、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)量都較高（P＜0.05），IFN-β無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

分別取EAP作用的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)即12 h，24 h和36 h，測定不同時(shí)段細(xì)胞因子的表達(dá)情況，從實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果來看，36 h時(shí)EAP的作用相對(duì)較好，IL-6，TNF-α和IFN-γ都得到了上調(diào)表達(dá)（P＜0.05）。IFN-β在3個(gè)時(shí)間段的結(jié)果不顯著（圖2-2C）。

4.2 紫莖澤蘭多糖對(duì)鼠源細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

4.2.1 不同濃度的EAP對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)選取了紫莖澤蘭多糖（EAP）濃度分別為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和 400μg/mL，分別作用于RAW264.7細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用相對(duì)熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明在200μg/mL時(shí)4種細(xì)胞因子的表達(dá)量都較高（P＜0.05）。

實(shí)驗(yàn)分別設(shè)定了紫莖澤蘭多糖的4個(gè)濃度梯度，50μg/mL、100μg/mL，200μg/mL和400μg/mL，另外設(shè)PBS空 白 對(duì) 照 組。IL-6、TNF-α、IFN-β 和IFN-γ 都 在EAP濃度為200μg/mL的時(shí)候表達(dá)量最高。200μg/mL的紫莖澤蘭多糖與PBS組相比差異顯著（P＜0.05）。

4.2.2 不同時(shí)間點(diǎn)EAP對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響

圖3 采用相對(duì)熒光定量PCR方法測定不同濃度的EAP對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響

圖4 采用相對(duì)熒光定量PCR方法測定不同時(shí)間點(diǎn)EAP對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響

圖5 測定不同濃度EAP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的吞噬李氏桿菌的刺激作用

實(shí)驗(yàn)選取的紫莖澤蘭多糖濃度為200μg/mL，分別作用時(shí)間12 h、24 h和36 h于A549細(xì)胞，提取RNA， 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用相對(duì)熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子IL-6、T N F-α、I F N-β和I F N-γ的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明EAP濃度200μg/mL作用36 h，IL-6、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)量都較高（P＜0.05），IFN-β結(jié)果不顯著。

從這4個(gè)因子（IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ)的表達(dá)情況來看，36 h與12 h和24 h相比，更具有優(yōu)勢(shì)，與對(duì)照組相比，差異顯著（P＜0.05）。

4.3 巨噬細(xì)胞的吞噬能力測定

實(shí)驗(yàn)測定了EAP濃度分別為100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL時(shí)RAW264.7細(xì)胞對(duì)李氏桿菌的吞噬作用，用LPS作陽性對(duì)照，結(jié)果表明200μg/mL的EAP具有促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞吞噬細(xì)菌的作用。

分別選取了100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL的EAP濃 度 梯 度，Lipopolysaccharides(LPS)為 50 ng/mL。以LPS為陽性對(duì)照，PBS為陰性對(duì)照，EAP作用36 h后，200μg/mL濃度的紫莖澤蘭多糖與陰性對(duì)照組相比吞噬能力較好(P＜0.05)。

5 分析與討論

目前關(guān)于植物多糖的抗氧化能力和增強(qiáng)宿主免疫活性的作用方面的研究還較少。本試驗(yàn)通過對(duì)體外人源細(xì)胞A549細(xì)胞和鼠源細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞因子的測定發(fā)現(xiàn)，在EAP濃度為200μg/mL，作用時(shí)間為36 h時(shí)表達(dá)水平較高。EAP對(duì)A549細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性與EAP的劑量成一定的依賴關(guān)系。EAP能顯著提高這2種不同來源細(xì)胞 IL-6，TNF-α，IFN-β，IFN-γ 的 mRNA的表達(dá)水平。IL-6主要由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的，IL-6可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、造血功能等，并在機(jī)體的抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。許多抗原或非抗原物質(zhì)可誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生，如植物多糖和細(xì)胞因子等，TNF-α和IL-6可以互相誘導(dǎo)產(chǎn)生，互相進(jìn)行調(diào)控。IL-6可通過核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）介導(dǎo)炎癥，NF-κB在激活上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等細(xì)胞中的各種促炎癥因子起著重要作用。TNF-α是由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等產(chǎn)生的能使腫瘤壞死的因子，脂多糖（LPS）、病毒、真菌、免疫復(fù)合物和其他非抗原物質(zhì)均具有刺激TNF-α產(chǎn)生的作用。TNF-α具有抗病毒、細(xì)菌、激活T細(xì)胞，促進(jìn)IL-6的產(chǎn)生和分泌的作用，并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)主要組織相容性抗原Ⅱ類抗原(MHCⅡAg)的表達(dá)等，與宿主防御反應(yīng)相關(guān)。TNF-α在濃度較低時(shí)，它主要作為內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞自分泌和旁分泌的調(diào)節(jié)物質(zhì)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，參與抗病毒、抗腫瘤作用等。干擾素（IFN）是動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞在誘導(dǎo)劑作用下產(chǎn)生的一組低分子量的具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性的糖蛋白。IFN-β具有免疫調(diào)節(jié)作用，它能促進(jìn)大多數(shù)細(xì)胞MHCⅠ類抗原的表達(dá)，激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和自然殺傷（NK）細(xì)胞，另外還具有一定的廣譜抗病毒作用。T細(xì)胞受到刺激后可產(chǎn)生IFN-γ，目前認(rèn)為，巨噬細(xì)胞活化因子（MAF）的主要活性存在于IFN-γ中，IFN-γ能誘導(dǎo)MHCⅡ類抗原的表達(dá)，協(xié)同TNF促進(jìn)細(xì)胞殺傷病原微生物。紫莖澤蘭多糖作為細(xì)胞體外刺激物，它能以一定的作用機(jī)制調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-6、TNF-α、IFN-β、IFN-γ的表達(dá)，這對(duì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)具有一定的作用。

以往的研究表明巨噬細(xì)胞受到刺激后，能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α。T細(xì)胞分泌的IL-6能刺激巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α已確定是重要的宿主調(diào)節(jié)分子，與腫瘤壞死相關(guān)。紫莖澤蘭多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞和A549細(xì)胞具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，這種結(jié)構(gòu)的多糖可能與細(xì)胞表面受體有一定關(guān)聯(lián)，從而導(dǎo)致免疫反應(yīng)的發(fā)生，但這還需要進(jìn)一步的研究加以證明。巨噬細(xì)胞在抵御宿主感染和破壞外來病原體和腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用。在哺乳動(dòng)物中，吞噬是一個(gè)重要的防御機(jī)制，它能夠使機(jī)體免受病原體的入侵，巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞具有清除作用。巨噬細(xì)胞的非特異性防御功能可能是在吞噬過程中消除階段通過激活溶酶體磷酸酶而發(fā)揮的，由于吞噬細(xì)胞的監(jiān)管和效應(yīng)細(xì)胞在免疫系統(tǒng)的作用，通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能，將適用于微生物感染和癌癥的治療領(lǐng)域。

研究結(jié)果表明，EAP可以刺激A549細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的免疫反應(yīng)，可能是由于提取方法，單糖單位，結(jié)構(gòu)特征和分子質(zhì)量等的綜合作用。也可能是由于巨噬細(xì)胞膜上的受體（包括dectin-1，甘露糖受體，Toll樣受體等），這些受體識(shí)別多糖將產(chǎn)生細(xì)胞增殖，引起一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）的產(chǎn)生，細(xì)胞因子或者趨化因子的生產(chǎn)，增強(qiáng)吞噬作用。一旦免疫反應(yīng)開始，巨噬細(xì)胞將使用NO、ROS或TNF-α攻擊外來病原體和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，然后吞噬或傳遞給抗原呈遞細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞來識(shí)別并消除它們。因此EAP被認(rèn)為是新型植物多糖，可以用來激活免疫系統(tǒng)，迅速形成巨噬細(xì)胞作為主體的第1道防線。因此， EAP對(duì)于免疫佐劑的開發(fā)或免疫調(diào)節(jié)劑的研制作用甚大，有可能會(huì)成為一種廣譜的抗病毒藥物。

略