手性藥物對映體分離檢測的研究式開放性實(shí)驗(yàn)*

謝天堯 劉丹 賴瑢 戴宗 陳六平 巢暉

(中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院 廣東廣州510275)

手性藥物在藥物中占很大的比例，其在生物體內(nèi)的吸收、分布和代謝均體現(xiàn)出立體選擇性，不同對映體往往顯示出不同的藥理學(xué)和毒理學(xué)特性［1］。由于對映異構(gòu)體除旋光性不同外，在非手性環(huán)境中的物理化學(xué)性質(zhì)完全相同，用一般的方法難以分離，因此手性藥物對映體的分離檢測是分析化學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一［2］。目前，手性藥物對映體的分離檢測一般采用高效液相色譜(HPLC)。但由于HPLC存在手性色譜柱價(jià)格昂貴，色譜柱難沖洗、易損壞，溶劑消耗量大和維護(hù)成本較高等缺點(diǎn)［2］，在很大程度上限制了采用HPLC技術(shù)開展手性藥物對映體分離檢測的實(shí)驗(yàn)教學(xué)(在國內(nèi)高校的儀器分析實(shí)驗(yàn)中幾乎是空白)。毛細(xì)管電泳(CE)結(jié)合電容耦合非接觸式電導(dǎo)檢測(C4D)的新型分離分析方法具有通用、靈敏、適用性強(qiáng)、易維護(hù)等優(yōu)點(diǎn);CE-C4D具有的高效、試劑消耗少、環(huán)境友好、分析成本低等特點(diǎn)使其在手性化合物的分離分析中極具應(yīng)用前景［2-3］。

在大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，開設(shè)研究式開放性實(shí)驗(yàn)是培養(yǎng)學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?、?chuàng)新能力以及社會(huì)適應(yīng)能力的有效途徑［4-7］。通過研究式開放性實(shí)驗(yàn)，學(xué)生既可以把基礎(chǔ)化學(xué)的理論知識(shí)和各種實(shí)驗(yàn)技能及方法有機(jī)地結(jié)合起來，教師也可以將科學(xué)研究中獲得的新知識(shí)及時(shí)地融入到實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)中，不斷地更新教學(xué)內(nèi)容。學(xué)生可以在做這類實(shí)驗(yàn)的過程中探索研究的方法和獲取新知識(shí)。本文介紹的“毛細(xì)管電泳/非接觸式電導(dǎo)分離檢測手性藥物氧氟沙星對映體”實(shí)驗(yàn)，是我們儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)小組在科研成果基礎(chǔ)上開發(fā)出來的，并已經(jīng)過我院4屆本科生的實(shí)際教學(xué)經(jīng)驗(yàn)積累的一個(gè)研究式開放性實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

熟悉高效毛細(xì)管電泳儀的基本原理和操作使用。了解毛細(xì)管電泳分離檢測手性藥物對映體的原理。學(xué)習(xí)和掌握手性藥物氧氟沙星對映體的CE-C4D分離檢測技術(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)原理

氧氟沙星(Ofloxacin，OFLX)是第3代喹諾酮類藥，屬于手性藥物，其對映體的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。目前臨床使用的為外消旋體氧氟沙星和光學(xué)純體的左旋氧氟沙星(S-OFLX)。左旋氧氟沙星的抗菌活性是右旋(R-OFLX)的8～128倍［8］。在羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)構(gòu)建的二元手性選擇劑體系中，HP-β-CD與R，S-OFLX形成主-客體結(jié)構(gòu)包結(jié)物，由于HP-β-CD具有多個(gè)手性中心，能與對映體之間存在較好的手性選擇作用，使得兩個(gè)對映體在電泳淌度上表現(xiàn)出明顯的差異。HPMC屬水溶性非離子型纖維素醚，是甲基纖維素中部分甲氧基被羥丙氧基置換時(shí)得到的產(chǎn)物，具有手性協(xié)同作用，可以進(jìn)一步穩(wěn)定HP-β-CD包含物和增加HP-β-CD的手性識(shí)別能力和選擇性，進(jìn)而繼續(xù)增加對映體在電泳淌度上的差異，從而實(shí)現(xiàn)對映體的CE-C4D基線分離和檢測。

圖1 氧氟沙星對映體的分子結(jié)構(gòu)示意圖

3 儀器與試劑

CES2008毛細(xì)管電泳儀(配備CES2008-C4D/CD-1B型雙通道電導(dǎo)檢測器，中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院研制)，熔融石英毛細(xì)管(di=50μm，Leff=40cm);超聲波清洗器。0.45μm尼龍濾膜濾頭。

HAc，NaAc，HP-β-CD，HPMC，氧氟沙星對照品，市售左旋氧氟沙星片劑和氧氟沙星片劑，所用試劑為分析純，水為超純水。

電泳運(yùn)行液:20mmol/L HAc+6mmol/L NaAc+12mg/L HPMC+35mmol/L HP-β-CD。

4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.1 石英毛細(xì)管的處理

在使用前，依次用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液、超純水和電泳運(yùn)行液分別沖洗毛細(xì)管柱5min，在超聲波清洗器中清洗進(jìn)樣瓶和儲(chǔ)液瓶。每兩次進(jìn)樣之間，用電泳運(yùn)行液沖洗毛細(xì)管柱3min，以保證良好的重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要用超純水清洗進(jìn)樣瓶、儲(chǔ)液瓶和毛細(xì)管。

4.2 樣品前處理

取市售左旋氧氟沙星和外消旋體氧氟沙星藥片各一片(標(biāo)示含量0.100g/片)，分別放入50mL容量瓶中，加入約25mL超純水，在超聲波清洗器中助溶3min，定容。藥液經(jīng)過0.45μm的濾膜過濾。取1.25mL濾液于25mL的容量瓶中，定容。進(jìn)樣時(shí)，用50μmol/L HAc+5mmol/L HP-β-CD稀釋到合適濃度，進(jìn)行CE-C4D分析。

4.3 實(shí)驗(yàn)條件及儀器參數(shù)

在毛細(xì)管電泳/非接觸式電導(dǎo)分離檢測手性藥物氧氟沙星對映體的實(shí)驗(yàn)中，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素較多。如:手性選擇劑和電泳運(yùn)行液的組成和濃度，分離電壓，進(jìn)樣電壓，進(jìn)樣時(shí)間等。在這些影響因素中，有些涉及對映體的分離度，有些涉及分析方法的精密度和重現(xiàn)性;有些是關(guān)鍵因素，有些是次要因素。學(xué)生帶著研究性質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以對這些影響因素有全面的認(rèn)識(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中就能感到思路清晰。

儀器的參數(shù)為:分離電壓為+13kV，電動(dòng)進(jìn)樣:+11kV，8s。檢測器的輸出信號經(jīng)數(shù)據(jù)工作站采集到微機(jī)中進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)處理、圖形顯示和數(shù)據(jù)文件存儲(chǔ)。實(shí)驗(yàn)在室溫、相對濕度＜70%的條件下進(jìn)行。

4.4 樣品分析及結(jié)果

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，按4.2節(jié)方法處理實(shí)際樣品和進(jìn)樣分析。樣品分析分為定性分析和定量分析兩部分。在定性分析步驟中，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法確定CE-C4D譜圖中與R，S-OFLX分別對應(yīng)的電泳峰。結(jié)果表明，S-OFLX出峰在前，R-OFLX出峰在后(圖2)。為消除基體干擾，可用標(biāo)準(zhǔn)加入法或采用藥片輔料作為空白的標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算片劑中氧氟沙星和左氧氟沙星的含量，兩種方法之間不存在顯著性差異。我們對某廠家同一批次的氧氟沙星藥片測定結(jié)果分別為0.103g/片和0.098g/片，與標(biāo)示值0.100g/片一致。

圖2 手性藥物氧氟沙星片劑的對映體分離CE-C4D譜圖

5 教學(xué)實(shí)施及教學(xué)效果

由于本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容較多，具有一定的復(fù)雜性和綜合度，因此將全部學(xué)生分成若干個(gè)小組，每組4～5人，每個(gè)小組指定一名小組長負(fù)責(zé)與教師聯(lián)絡(luò)。各小組獨(dú)立開展工作，小組內(nèi)學(xué)生既有分工，又有合作。學(xué)生確定目標(biāo)后，即著手查資料，研讀文獻(xiàn)。在此基礎(chǔ)上，先由學(xué)生提出實(shí)驗(yàn)方案，經(jīng)與教師討論修改后，即可開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要求每個(gè)學(xué)生獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的最后部分是思考題，要求學(xué)生解答電泳運(yùn)行液中各組分所起的作用，電泳譜圖中各電泳峰的歸屬和成因;并對本文方法與文獻(xiàn)方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)室對學(xué)生全天開放(包括周末)，學(xué)生只要有時(shí)間，就可以到實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)。學(xué)生帶著自己設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中既可以發(fā)揮集體的智慧，又能發(fā)揮學(xué)生個(gè)人的主觀能動(dòng)性。學(xué)生可以利用學(xué)校圖書館、校園網(wǎng)絡(luò)查閱和收集參考資料，汲取自己所需要的知識(shí)信息解決實(shí)際問題;并運(yùn)用所學(xué)過的理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的目標(biāo)，經(jīng)歷了知識(shí)轉(zhuǎn)化為實(shí)際工作能力的過程。這一過程培養(yǎng)了學(xué)生解決問題的能力，可使他們正確運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)資源，體會(huì)到探索的樂趣。

這個(gè)研究式開放性實(shí)驗(yàn)具有效率高、試劑消耗少、分析成本低的優(yōu)點(diǎn)。目前在中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院經(jīng)過多年儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)踐，深受學(xué)生的歡迎，取得了良好的教學(xué)效果。

［1］黃量，戴立信.手性藥物的化學(xué)與生物學(xué).北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002

［2］汪爾康.分析化學(xué)新進(jìn)展.北京:科學(xué)出版社，2006

［3］北京大學(xué)化學(xué)系.儀器分析教程.第2版.北京:北京大學(xué)出版社，2007

［4］施開良，姚天揚(yáng)，俞慶森.大學(xué)化學(xué)，2002，17(6):8

［5］施開良，姚天揚(yáng).中國高等教育，2003，17:27

［6］段連運(yùn)，華彤文.大學(xué)化學(xué)，2005，20(6):5

［7］侯文華，丁維平，王志林.大學(xué)化學(xué)，2010，25(3):7

［8］國家藥典委員會(huì)編.中國藥典(2005版).北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005