誘導(dǎo)子在人參細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

梁瑩，張美萍，孫春玉，蔣世翠，王義，張斯童，紀(jì)東輝

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春130118)

人參(PanaxginsengC.A.Mey)是我國(guó)古老而名貴的藥用植物，人參皂苷是人參的主要有效成分，具有保護(hù)心臟、提高免疫力、抗疲勞、保護(hù)肝臟等廣泛的藥理作用[1]，但人參皂苷含量很低，且尚未實(shí)現(xiàn)人工合成，通常大田栽培獲得的人參中含量?jī)H為3%左右[2]。采用植物細(xì)胞培養(yǎng)手段實(shí)現(xiàn)人參皂苷的快速、大量積累是克服大田栽培周期長(zhǎng)、對(duì)栽培環(huán)境要求苛刻的最有效手段。因此，應(yīng)用生物學(xué)等手段進(jìn)行有目的地調(diào)控人參皂苷的生物合成已受到越來(lái)越多學(xué)者們的關(guān)注。

從細(xì)胞培養(yǎng)的角度講，誘導(dǎo)子(elicitor)是指對(duì)植物細(xì)胞目的產(chǎn)物產(chǎn)生促進(jìn)作用的因子。從植物病理學(xué)的角度講，是指在植物抗病過(guò)程中，能誘發(fā)植物產(chǎn)生植物抗毒素和引起植物過(guò)敏反應(yīng)，包括侵染植物的微生物及植物細(xì)胞內(nèi)的分子。誘導(dǎo)子在植物與微生物之間相互作用，能快速、專一性地誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)[3]。眾多研究表明，誘導(dǎo)子能夠有效地調(diào)控植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的合成，并能促進(jìn)其分泌到培養(yǎng)基中[4]。人參皂苷作為人參屬植物的一種次生代謝產(chǎn)物，是研究植物次生代謝信號(hào)識(shí)別及其細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的良好實(shí)驗(yàn)體系。利用誘導(dǎo)子處理人參細(xì)胞培養(yǎng)物，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成，已成為國(guó)內(nèi)、外學(xué)者們廣泛重視的新方法。本文就各種誘導(dǎo)子對(duì)人參細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)皂苷的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 誘導(dǎo)子的分類

從植物的防衛(wèi)反應(yīng)角度不同來(lái)劃分，誘導(dǎo)子可分為外源誘導(dǎo)子(exogenous elicitor)和內(nèi)源誘導(dǎo)子(endogenous elicitor)。外源誘導(dǎo)子是指植物細(xì)胞細(xì)胞壁的果膠多糖類等來(lái)自植物細(xì)胞的誘導(dǎo)子；內(nèi)源誘導(dǎo)子是指各種病原菌分泌的代謝物等來(lái)自植物細(xì)胞外的誘導(dǎo)子。從誘導(dǎo)子特異性方面劃分，可分為特異性誘導(dǎo)子(specificity elicitor)和非特異性誘導(dǎo)子(non-specificity elicitor)。從化學(xué)組成上劃分，誘導(dǎo)子可分為蛋白質(zhì)類誘導(dǎo)子、多糖類誘導(dǎo)子、多肽類誘導(dǎo)子及脂類誘導(dǎo)子。從來(lái)源上劃分，誘導(dǎo)子可分為生物誘導(dǎo)子(biotic elicitor)和非生物誘導(dǎo)子(abiotic elicitor)[5]。生物誘導(dǎo)子是指植物在防御過(guò)程中為了對(duì)抗微生物感染所產(chǎn)生的物質(zhì)，包括各種病原菌(細(xì)菌、真菌、酵母及病毒等)、植物細(xì)胞分離物和代謝物、降解細(xì)胞壁的酶類以及培養(yǎng)物濾液中的成分，其中主要為細(xì)胞壁水解物；非生物誘導(dǎo)子是指能起到誘導(dǎo)作用的紫外線、輻射、凍融等物理因子和乙烯、氯仿、重金屬鹽類、殺真菌劑、去污劑等化學(xué)因子[6]。

本文主要從生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子的角度綜述不同來(lái)源的誘導(dǎo)子在人參皂苷合成中的應(yīng)用。

2 生物誘導(dǎo)子在人參皂苷合成研究中的應(yīng)用

2.1真菌誘導(dǎo)子

真菌誘導(dǎo)子來(lái)源于真菌，能引起植物細(xì)胞合成并能快速、專一地促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物積累。近年來(lái)，關(guān)于真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)人參細(xì)胞培養(yǎng)物中人參皂苷積累的研究屢見(jiàn)報(bào)道[7]。

隋昌海等[8]以人參根際優(yōu)勢(shì)菌種地球囊霉作為誘導(dǎo)子來(lái)提高人參培養(yǎng)物中人參皂苷的含量發(fā)現(xiàn)，在人參愈傷組織生長(zhǎng)第21天(即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期晚期)加入濃度為0.10mg/mL的誘導(dǎo)子，皂苷含量達(dá)到3.6%，是對(duì)照組的1.63倍。

劉峻等[9]選擇不同濃度的棉花枯萎病菌、黑曲霉、黃瓜碳疽病菌及青菜炭疽病菌作為誘導(dǎo)子，研究其對(duì)人參發(fā)狀根生長(zhǎng)及皂苷合成的影響。結(jié)果表明，濃度為40mg/L～800mg/L的棉花枯萎病菌能抑制發(fā)狀根的生長(zhǎng)及皂苷合成；20mg/L的黑曲霉能夠促進(jìn)總皂苷合成，是對(duì)照組的1.46倍，且濃度在20mg/L～400mg/L的范圍內(nèi)均可促進(jìn)發(fā)狀根的生長(zhǎng)；濃度為800mg/L時(shí)，黃瓜炭疽病菌可促進(jìn)總皂苷的合成，總苷含量為3.636%，是對(duì)照組的1.46倍，但此濃度抑制發(fā)狀根的生長(zhǎng)；青菜炭疽病菌在40mg/L～800mg/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)發(fā)狀根的生長(zhǎng)呈抑制作用，但對(duì)總皂苷合成有促進(jìn)作用。

劉長(zhǎng)軍等[10]分別用黑曲霉、尖孢鐮刀菌、刺盤(pán)孢菌和莖點(diǎn)屬菌菌絲體制備誘導(dǎo)子，添加于人參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，研究不同濃度的誘導(dǎo)子對(duì)人參皂苷合成量的影響，結(jié)果表明，在人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)初期加入20μg/mL的黑曲霉，培養(yǎng)23d后收獲，皂苷含量可提高到細(xì)胞干重的6.8%，是對(duì)照組的1.3倍。在人參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的第15天分別加入4種誘導(dǎo)子發(fā)現(xiàn)，各組中人參皂苷積累時(shí)間分別較對(duì)照組提前了2d～4d，縮短了培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)提高了皂苷產(chǎn)率。添加真菌誘導(dǎo)子后的培養(yǎng)基中，皂苷含量明顯高于對(duì)照，占細(xì)胞總量的80%以上，其中用刺盤(pán)孢菌菌絲體處理后的培養(yǎng)基中皂苷含量達(dá)到179mg/L，是對(duì)照組的1.2倍。這說(shuō)明真菌誘導(dǎo)子能夠促進(jìn)人參皂苷的外排，對(duì)人參皂苷的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)中產(chǎn)物的連續(xù)回收和節(jié)約成本十分有利。

2.2酵母提取物

酵母提取物(Yeast Extract，YE)是指酵母經(jīng)破壁后將其中蛋白質(zhì)、核酸、維生素等抽提，再經(jīng)生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、維生素等天然活性成分的物質(zhì)。YE是植物細(xì)胞培養(yǎng)中常用的誘導(dǎo)子，能誘導(dǎo)或促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的形成。

周倩耘等[11]研究了YE對(duì)人參發(fā)狀根中皂苷含量的影響，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中添加0.10mg/mL的YE，總皂苷含量為3.595%，是對(duì)照組的1.57倍，Rg1、Re、Rb1、Rd含量分別為0.192%、0.189%、0.231%、0.108%，分別是對(duì)照組的1.35倍、1.42倍、1.28倍和1.29倍，培養(yǎng)基中總皂苷含量為0.025%。這說(shuō)明YE不僅能促進(jìn)人參發(fā)狀根中總皂苷和單體皂苷的積累，還能促進(jìn)人參皂苷的外排，推測(cè)可能是由于YE中的Zn2+、Ca2+等陽(yáng)離子及寡糖素影響了次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控[12]。

K.MCY等[13]在人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中添加酵母誘導(dǎo)子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酵母誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的新鮮細(xì)胞中能產(chǎn)生一種新的化合物2，5-二羥基-1，4-苯醌(2，5-dinethoxy-1，4-benzoquinone)，且在12h時(shí)達(dá)到最高水平(65.10μg/g±4.96μg/g)。

3 非生物誘導(dǎo)子在人參皂苷生物合成中的應(yīng)用

3.1茉莉酸甲酯

茉莉酸甲酯(MeJA)是茉莉酸類植物內(nèi)源激素，作為植物體內(nèi)的一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在次生代謝物合成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。MeJA是一類特殊的環(huán)戊烷衍生物型植物激素，調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物生物合成的一系列酶促反應(yīng)。

義7-6塊主力含油層系為下第三系沙河街組沙三段9砂組。油藏平均埋深3 500m。砂層組厚度一般20～40m，砂體呈東南-西北向條帶狀展布，橫向?qū)挾仍?km左右，為單一水道。義7-6塊位于水道的邊部。該區(qū)塊油井滲透率差異較大，中心部?jī)?chǔ)層條件較好的油井測(cè)井滲透率可達(dá)35×10-3μm2，邊部的滲透率為（3～15）×10-3μm2，屬中孔、（特）低滲儲(chǔ)層。義7-6塊沙三下儲(chǔ)層類型類似樊142塊，滲透率較樊142塊低，井距較樊142塊大，注水見(jiàn)效慢，因此根據(jù)儲(chǔ)層特性優(yōu)化井網(wǎng)、井距，并與壓裂規(guī)模的合理匹配是直井長(zhǎng)縫開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵。

王士杰等[1]研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能夠促進(jìn)人參發(fā)狀根的生長(zhǎng)，通過(guò)向培養(yǎng)物中添加10μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和500μmol/L的MeJA，確定了濃度在200μmol/L時(shí)誘導(dǎo)10d效果最好，人參發(fā)根生物量增長(zhǎng)13.82倍，總皂苷含量達(dá)到了2.28%，比對(duì)照組高35.71%。

徐立新等[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，MeJA在較低濃度的時(shí)候?qū)傇碥盏姆e累和人參發(fā)根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。當(dāng)其濃度為0.001mmol/L時(shí)，總皂苷產(chǎn)量為0.120 7g/L。其中Rb1產(chǎn)量為11.41mg/L。升高M(jìn)eJA濃度為1.000mmol/L時(shí)，Rb1產(chǎn)量?jī)H為6.5mg/L。

沈旭等[15]的研究結(jié)果表明，在人參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)第7天分別添加10μM、100μM、200μM、400μM的MeJA，培養(yǎng)11d收獲，測(cè)得MeJA對(duì)人參懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用，并且抑制程度隨著添加濃度的上升而上升，但是次生代謝產(chǎn)物的含量卻隨之而上升。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，第7天添加100μM的MeJA能夠促進(jìn)人參細(xì)胞單體皂苷含量的提高。

3.2水楊酸

水楊酸(Salicylic acid，SA)即鄰羥基苯甲酸，廣泛存在于高等植物體內(nèi)。有研究表明，SA不僅參與植物體內(nèi)的許多生理過(guò)程，還與植物抗病反應(yīng)關(guān)系密切，可被看作為一種新的植物激素。

徐立新[14]等在人參毛狀根培養(yǎng)中添加SA，探討不同濃度的SA對(duì)人參總皂苷和單體皂苷含量的影響結(jié)果表明，SA的添加對(duì)人參發(fā)狀根中總皂苷的積累無(wú)明顯促進(jìn)作用，且隨著SA濃度的增大，對(duì)皂苷的合成顯示了抑制作用，當(dāng)SA濃度為0.100mmol/L時(shí)，總皂苷含量最高(0.1008g/L)；適當(dāng)濃度的SA能促進(jìn)Rb1的積累，當(dāng)SA濃度為0.100mmol/L時(shí)，Rb1產(chǎn)量最高(11.49mg/L)。

張悅等[18]研究了不同濃度的SA對(duì)人參愈傷組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，在愈傷組織培養(yǎng)的第28天添加0.001mg/L的SA，培養(yǎng)35d后收獲，皂苷含量達(dá)到3.5%，是對(duì)照組的1.3倍。實(shí)驗(yàn)證明了SA影響人參培養(yǎng)物的過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶活力。向愈傷組織中添加SA，作用14h后過(guò)氧化物酶(POD)的活力開(kāi)始發(fā)生變化，24h酶活力最佳，是對(duì)照組的1.5倍，隨后活性開(kāi)始下降，72h后與對(duì)照組基本接近；添加SA 18h后，多酚氧化酶活力達(dá)到最高值，48h后人參培養(yǎng)物中多酚氧化酶的活力仍然高于對(duì)照；添加SA的24h內(nèi)人參愈傷組織中的苯丙氨酸解氨酶的活力低于對(duì)照組，24h后迅速升高，48h活力達(dá)到最大值，是對(duì)照的1.87倍。

3.3重金屬鹽類

重金屬鹽(銅、鉛、鋅、鐵、鈷、鎘等)屬于無(wú)機(jī)誘導(dǎo)劑中的一類，能夠影響、調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物合成。與其他誘導(dǎo)劑相比，重金屬鹽類來(lái)源廣泛、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)性較好[19]。

黃超等[20]研究了釩酸鹽對(duì)人參細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中皂苷合成的影響。在細(xì)胞培養(yǎng)的第4天添加50μM的釩酸鹽(NH4VO3)，皂苷含量達(dá)到499.3μg/100mg DW。同時(shí)，研究了在皂苷合成中2個(gè)關(guān)鍵酶UGRdGT和P6H的變化情況。這2個(gè)皂苷合成關(guān)鍵酶的酶活性在釩酸鹽加入后有顯著的增加，并同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)的第6天達(dá)到了最大值。添加誘導(dǎo)子作用后的第4天～第10天內(nèi)，UGRdGT和P6H的酶活性都明顯高于對(duì)照組。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)，分析了經(jīng)釩酸鹽誘導(dǎo)后的第6h、12h、24h和48h后的基因轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)時(shí)變化情況。結(jié)果表明，經(jīng)釩酸鹽誘導(dǎo)后，4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平都有顯著的增加。添加誘導(dǎo)子12h后，鯊烯合成酶(Squalene synthetase，SQS)、鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase，SQE)和達(dá)瑪烷合成酶(Dammarenediol synthase，DS)的轉(zhuǎn)錄水平分別是對(duì)照組的7.6倍、10.3倍和17.8倍。12h～36h內(nèi)，SQS的基因轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異，而SQE的基因轉(zhuǎn)錄水平仍然顯著高于對(duì)照組。在6h～48h內(nèi)，環(huán)阿屯醇合成酶(Cycloartenol Synthase，CAS)的基因轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組沒(méi)有明顯變化。人參皂苷合成關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的快速上調(diào)促進(jìn)了皂苷合成。

4 展望

在適宜條件下，通過(guò)添加誘導(dǎo)子來(lái)提高植物細(xì)胞中有益次生代謝物的含量，特別是運(yùn)用誘導(dǎo)子手段調(diào)控人參皂苷代謝途徑，提高人參細(xì)胞培養(yǎng)物中人參皂苷的含量，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。目前對(duì)于誘導(dǎo)子在人參細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究取得了一定進(jìn)展，但還存在一些不夠完善的地方，例如誘導(dǎo)子和代謝產(chǎn)物之間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、誘導(dǎo)子受體的提取純化等，這些問(wèn)題導(dǎo)致了誘導(dǎo)子作用機(jī)制的不確切性，如果上述問(wèn)題能有效地解決，就可用現(xiàn)代分子技術(shù)在分子水平上闡明人參皂苷的合成機(jī)制，為今后的誘導(dǎo)培養(yǎng)人參細(xì)胞提供可靠的理論依據(jù)。

[1]王士杰.茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的人參發(fā)根培養(yǎng)及SSH文庫(kù)構(gòu)建的研究[D].長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[2]王建華.人參、西洋參發(fā)根體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2009.

[3]余龍江,朱敏,周瑩,等.茉莉酸甲酯對(duì)紫杉醇生物合成的誘導(dǎo)作用[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),1998,1(5):1-6.

[4]王紅,葉和春,李國(guó)鳳.誘導(dǎo)子的作用方式及其在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].植物學(xué)通報(bào),1999,16(1):11-18.

[5]李文淵,高偉,邵愛(ài)娟,等.誘導(dǎo)子對(duì)丹參有效成分次生代謝的誘導(dǎo)與調(diào)控[J].中國(guó)中藥雜志,2011,(2):258-262.

[6]仇燕,賈寧,王麗,等.誘導(dǎo)子在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào),2003,20(2):184-189.

[7]寧文,曹日強(qiáng).真菌誘導(dǎo)物在植物次生代謝中的調(diào)節(jié)作用[J].植物生理學(xué)通訊,1993,29(5):321-329.

[8]隋昌海.真菌誘導(dǎo)子調(diào)控人參皂苷合成的研究[D].長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[9]劉峻,丁家宜,周倩耘,等.真菌誘導(dǎo)子對(duì)人參毛狀根皂苷生物合成和生長(zhǎng)的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2004,29(4):302-305.

[10]Liu C S,Hou S.S1Regulation of fungal elicitors on the cell growth and biosynthesis of saponin of Panax ginseng cell suspension culture[J].Acta Biol Exp Sin,1999,32(2):169-174.

[11]周倩耘,周建民,劉峻,等.誘導(dǎo)子對(duì)人參毛狀根中皂苷含量的影響[J].南京軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,25(2):76-78.

[12]Suzuki T,Mori H,Yamame T,et al.Automatich supplementation of minerals in fed-batch culture to high cell mass concentration[J].Biotech Bioeng,1985,27:192-201.

[13]Kim CY,IMHW,KIMHK,et al.Accumulation of2,5-dimethoxy-1,4-benzoquinone in suspension cultures of Panax ginseng by a fungal elicitor preparation and a yeast elicitor preparation[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2001,56(1,2):239-242.

[14]徐立新,趙壽經(jīng),梁彥龍,等.外源調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)人參毛狀根生長(zhǎng)及皂苷合成的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào),2010,40(6):1619-1923.

[15]沈旭.茉莉酸類化合物誘導(dǎo)葡萄細(xì)胞生產(chǎn)白藜蘆醇和人參細(xì)胞生產(chǎn)皂苷的研究[D].上海:華東理工大學(xué),2012.

[16]Durner J,Shah J,Klessig DF.Salicylic acid and disease resistance in plants[J].Trends in Plant Sci,1997,(2):266-274.

[17]Malamy J,Sanchez-Casas P,Hennrg J,et al.Dissection of the salicylic acid signaling pathway in tobacco[J].Mol Plant-Microbe Interactions,1996,(9):474-482.

[18]張悅.水楊酸誘導(dǎo)下人參培養(yǎng)物差異表達(dá)基因片段的克隆[D].長(zhǎng)春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[19]Popp MP,Lesney MS,Davis JM.Defense responses elicited in plant cell suspension culture[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,1997,47:199-206.

[20]黃超.小分子化合物的添加提高人參皂苷產(chǎn)量及其作用機(jī)制探索[D].上海:華東理工大學(xué),2013.