β—actin基因在荒漠昆蟲光滑鱉甲和小胸鱉甲中表達的穩(wěn)定性研究

孟閃閃+馬文靜+劉小寧+馬紀

摘 要：為檢測生活習性截然相反的兩種荒漠昆蟲光滑鱉甲和小胸鱉甲的β-actin基因在不同溫度下的表達是否穩(wěn)定，對不同溫度處理和不同季節(jié)采集的昆蟲提取總RNA反轉錄合成cDNA后，進行熒光實時定量PCR檢測。以Ct值作為β-actin基因表達水平的測定值。通過方差分析顯示：光滑鱉甲的β-actin基因在不同季節(jié)無顯著差異，而小胸鱉甲則表現出β-actin基因表達的季節(jié)性差異；在不同溫度處理條件下，光滑鱉甲β-actin基因表達比小胸鱉甲的要穩(wěn)定。研究認為β-actin可作為研究光滑鱉甲不同溫度下基因表達的內參基因，而β-actin則不適合用做研究小胸鱉甲在不同溫度下基因表達的內參基因。

關鍵詞：β-actin； 內參基因；光滑鱉甲；小胸鱉甲；實時定量PCR

中圖分類號：S188 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.001

Expression Stability of β-actin Gene in the Desert Insects Microdera punctipennis and Anatolica polita

MENG Shan-shan，MA Wen-jing，LIU Xiao-ning，MA Ji

（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering， College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi，Xinjiang 830046， China）

Abstract： In order to measuring the expression stability of the β-actin gene at different temperatures in two desert insects， Microdera punctipennis and Anatolica polita， which have quite contrary living habit，total RNA from the insects collected in different seasons， or treated at different temperatures was extracted and reverse transcribed to synthesize cDNAs. The expression of the β-actin genes from these two species was measured by Ct values which were obtained by real-time quantitative PCR. The results showed that there were no significant changes in the expression of β-actin gene in Anatolica polita over seasons， while in Microdera punctipennis the expression of β-actin gene changed significantly. When the beetles were treated at different temperatures， the expression of β-actin gene in Anatolica polita was more stable than that in Microdera punctipennis. β-actin gene in Anatolica polita could be used as a reference gene for study gene expression at different temperatures， while it is not suitable in Microdera punctipennis for study gene expression at different temperatures.

Key words： β-actin； reference gene； Microdera punctipennis； Anatolica polita； real-time PCR

β-actin是肌細胞骨架微絲的主要成分，具有收縮功能，參與胞質分裂、形態(tài)維持、生長等多種重要的生理活動，是一類高度保守的蛋白質[1]。β-actin具有分布廣泛、mRNA表達量高、數量穩(wěn)定等特點，因此被稱為看家基因。傳統(tǒng)的RT-PCR及實時熒定量PCR（qRT-PCR）等技術多選用看家基因作為內標來評價目的基因的相對表達量。常用的內標基因有β-actin、18SrRNA、28SrRNA和GAPDH（甘油醛3-磷酸脫氫酶）等，其中β-actin可在多個物種內持續(xù)恒量地表達，因而常被用做內參基因[2-3]。例如，粘蟲的β-actin基因在6種不同組織間的表達無顯著差異[4]。然而，大量研究表明，看家基因所謂的恒定表達都只是在一定類型的細胞或試驗因素作用下“有范圍”的恒定，在其他類型的細胞中或試驗因素作用下則是變化的，有時可能是十幾倍、幾十倍甚至上百倍的差異，盲目地使用一種看家基因作為內參，一方面可能使基因表達的微小差異難以發(fā)現，另一方面可能會導致錯誤甚至相反的結論[5-6]。通過實時定量PCR證明，actin、RPS18和GAPDH在意大利蜂的細菌脅迫前后表達最穩(wěn)定，可做為內參基因[7]。GAPDH的表達隨牙鲆的變態(tài)發(fā)育發(fā)生波動，β-actin較為穩(wěn)定，18S是最穩(wěn)定的[8]。因此，研究目標基因的表達情況時，根據樣本的不同，選擇合適而穩(wěn)定的內參基因進行校正和標準化，將有助于得到可靠的試驗結果。

小胸鱉甲（Microdera punctipennis）和光滑鱉甲（Anatolica polita borealis）是兩種分布于古爾班通古特沙漠的荒漠擬步甲科昆蟲[9-10]。小胸鱉甲成蟲避光喜陰，夏季的白天棲居于灌叢的根部，夜晚活動，冬季藏于沙土中；光滑鱉甲成蟲喜光耐熱，日間活動，早晚溫度較低時很少出現。古爾班通古特沙漠氣候特征為典型的溫帶大陸性極端干旱氣候，年溫差和晝夜溫差巨大，氣溫變化劇烈。這兩種昆蟲在此極端環(huán)境下都能克服干旱、低溫和高溫的影響，能很好地適應環(huán)境溫度變化。利用實時定量PCR技術從基因表達水平研究它們的環(huán)境適應機制，將有助于加強人類對荒漠極端生物類群的認識。β-actin基因作為常用的內參基因，其在不同溫度條件下在兩種昆蟲中的表達是否穩(wěn)定需要鑒定，以便確定是否可以作為內參基因。

1 材料和方法

1.1 試 蟲

荒漠昆蟲小胸鱉甲（M.punctipennis ）和光滑鱉甲（A.polita）均采自于新疆阜康市222團（44°24N， 087°51′E）的準噶爾盆地古爾班通古特沙漠南緣地帶（距離亞洲大陸地理中心約100 km）。采集時間為3月份積雪開始融化時，至11月份入冬后。采集的新鮮樣本保存到液氮中，其余樣本在室內培養(yǎng)箱內進行短期飼養(yǎng)，溫度控制在25 ℃，光周期設置為16L∶8D，喂食飼料及蔬菜等。

1.2 試蟲的溫度處理

野外采集的小胸鱉甲和光滑鱉甲成蟲在室溫下飼養(yǎng)一天，待其恢復正常狀況后分別取30只置于10 ℃處理5 h，然后將各組昆蟲轉至20，30，40 ℃ 處理5 h，使其形成10，20，30 ℃的溫差。各組取出4只速凍于液氮中。另外，分別取60只昆蟲置于5，10，15，37，42，47 ℃下各放置1，3，5 h。以無任何處理的試蟲作為對照，各組取出4只速凍于液氮中，再轉至-80 ℃超低溫冰箱中，以便RNA的提取和后期相關的試驗。

1.3 試 劑

Tag DNA聚合酶、DnaseⅠ、dNTP Mixture、Rnase Inhibitor、Oligo（dT）、Reverse Transcriptase M-mLV（RNase H-）、DNA Marker、 pMD19-T均為大連TaKaRa公司產品。 DNase/RNase-Free ddH2O、SYBR Green Supermix kit 為Invitrogen 公司產品；DEPC為上海生工生物工程技術服務公司產品；Trizol RNA提取試劑為Invitrogen公司產品；大腸桿菌DH 5α菌株為本實驗室保藏菌種，其余所用的化學試劑（無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇等）均為國產分析純。

1.4 PCR引物的設計

根據GenBank中已經發(fā)表的家蠶（Bombyx mori）和果蠅（Drosophila melanogaster）以及煙草天蛾（Manduca sexta）的β-actin基因，分析它們的核酸序列同源性，在其保守位點設計用于擴增小胸鱉甲（Mp）和光滑鱉甲（Ap）β-actin基因的引物：

Mpβ-actin F 5′-TACTCCGTATGGATCGGTGGATC-3′；

Mpβ-actin R 5′-TTAGAAGCACTTGCGGTGGAC-3′；

Apβ-actin F 5′- GCGACTTGACCGACTACCT -3′；

Apβ-actin R 5′- CCGCACGATTCCATACCC -3′。

1.5 昆蟲總RNA的提取及cDNA的獲得

使用TRIzol法提取昆蟲總RNA。將蟲體置于液氮中研磨至粉末狀，加入到1 mL的Trizol裂解液中，充分振蕩混勻，靜置 10 min后于 4 ℃，12 000 r·min-1，離心10 min。將上清轉移到新離心管，加入200 μL氯仿震蕩混勻，室溫放置5 min后于 4 ℃，12 000 r·min-1，離心15 min。將400～500 μL上清轉至新離心管中，然后加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10 min，使核酸沉淀完全（靜置時有絮狀沉淀物產生），4 ℃，12 000 r·min-1，離心 15 min，棄去上清，然后加入1 mL 70%的乙醇，混勻，4 ℃，12 000 r·min-1，離心5 min，（此步驟重復2遍）。棄去上清，室溫干燥3 min，然后溶于DEPC處理過的水中，通過紫可見分光光度計（NanoDrop ND-1000 spectrophotometer）檢測總RNA的濃度和純度。RNA提取后加入 DNA 酶對基因組進行消化。反轉錄使用MLV反轉錄酶、dNTP Mixture、Oligo Dt、 Adaptor PrimerA（TaKaRa公司），用20 uL體系進行反應，反應條件為：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min。反應結束后，將反轉錄產物cDNA置于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標準質粒的構建

分別以小胸鱉甲和光滑鱉甲的cDNA為模板，以熒光定量PCR設計的引物擴增β-actin基因，1%凝膠電泳檢測目的片段的大小，將PCR產物切膠回收后構建至pMD19-T 載體上，轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于Amp抗性的LB平板上，挑取單個白色菌落進行培養(yǎng)，堿裂解法制備質粒，酶切（EcoR I/Hind III）質粒鑒定其正確性，作為制作熒光定量PCR的標準質粒。

1.7 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR反應按照操作說明（帶有ROX的Platinum SYBR GREEN qPCR SuperMix-UDG，Invitrogen公司）進行，所用方法為SYBE GREENⅠ的熒光染料法。將cDNA 進行5倍稀釋后備用。取2 μL逆轉錄產物進行PCR反應，將PCR反應的熒光檢測管放入Gene Amp Thermal Cycler 9600中進行熒光定量PCR反應。每個樣品重復2次。采用以下PCR反應程序，擴增小胸鱉甲β-actin基因的PCR反應條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，5 min；95 ℃，15 s；58 ℃，30 s；72 ℃，30 s；45個循環(huán)。每次PCR程序完成后，設置72 ℃開始檢測產物溶解曲線。記錄Ct值。擴增光滑鱉甲β-actin的PCR反應條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，59 ℃，30 s，72 ℃，30 s，45個循環(huán)。每次PCR程序完成后，設置72 ℃開始檢測產物溶解曲線。記錄Ct值。由于Ct值與利用標準曲線計算的拷貝數的對數在統(tǒng)計分析中具有相同的結果，因此我們直接采用Ct值作為表達量的計算指標。

1.8 數據分析

采用醫(yī)學生物統(tǒng)計學軟件 GraphPad Prism 4.0 對Ct值進行統(tǒng)計分析。分別對Mpβ-actin 和Apβ-actin在季節(jié)性表達的相對轉錄水平做單因素方差分析。當它們的差異顯著時，則采用多重比較，進一步分析它們之間的差異性。對溫度處理的數據做兩因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 實時定量PCR的溶解曲線與標準曲線

經PCR反應后，儀器生成β-actin基因擴增的溶解曲線，兩組曲線均無雜峰出現（圖1A、B），說明試驗過程中無樣品污染和引物二聚體，擴增產物單一，可確定為特定的目的片段。由于片段大小不同，小胸鱉甲Mpβ-actin基因的擴增片段（120 bp）的熔解峰在82 ℃，而光滑鱉甲Apβ-actin基因擴增片段（246 bp）的溶解峰在89 ℃。

將Mpβ-actin和Apβ-actin基因片段的質粒作10倍梯度稀釋（101，102，103，104，105，106，107，

109倍）進行實時定量PCR檢測。結果顯示在101～109范圍內，Ct值與Mpβ-actin和Apβ-actin基因有較高的線性關系（圖1C、D），Mpβ-actin的標準曲線的R2=0.999 1、斜率為-3.324 8、擴增效率為99.526%。Apβ-actin標準曲線的R2=0.999 1、斜率為-3.326 1、擴增效率為99.526%。這表明標準曲線可以在較寬的范圍內用于Mpβ-actin和Apβ-actin基因的絕對定量。由于基因表達的絕對定量值是指數式的，不滿足線性關系進行方差分析，所以在本文的分析中直接采用Ct值作為基因表達的相對指標進行各種條件下基因表達水平的比較。

2.2 小胸鱉甲和光滑鱉甲β-actin基因的季節(jié)性表達

將不同月份采集的小胸鱉甲和光滑鱉甲成蟲分別用液氮處死后，提取總RNA，反轉錄為cDNA，進行實時定量PCR檢測β-actin基因的表達。Ct值結果顯示小胸鱉甲在5月和8、9月份的Ct值分別為18.02，17.94，17.99（表1），顯著高于其他月份（F7，16=19.02，F0.05（7，16）=2.668 4，P<0.05），表明小胸鱉甲β-actin基因的表達量隨季節(jié)變化有顯著性差異。不同季節(jié)之間的變異系數為0.033。而光滑鱉甲的β-actin基因擴增的Ct值在不同季節(jié)無顯著性差異（F5，12=0.495，F0.05（5，12）=3.106，P>0.05）（表1）。季節(jié)性表達水平的變異系數是0.011 7，小于小胸鱉甲的0.033。

2.3 小胸鱉甲和光滑鱉甲β-actin基因在不同溫差條件下的表達

荒漠地區(qū)晝夜溫差巨大，在夏季也經常達到30 ℃左右。檢測不同溫度差值對基因表達的影響是研究荒漠昆蟲環(huán)境適應性分子機制的重要內容。通過 10，20，30 ℃ 溫差處理昆蟲后，在兩種昆蟲中β-actin基因的表達量都呈上升趨勢，但是尚未達到顯著水平（表 2）。方差分析結果顯示，小胸鱉甲的F2，6，0.05=2.106，光滑鱉甲的F2，6，0.05=■，F0.05（2，6）=5.143（P>0.05）。

2.4 小胸鱉甲β-actin基因在不同溫度下的表達

將小胸鱉甲成蟲在不同溫度（5～47 ℃）處理1，3，5 h 后，提取總RNA，反轉錄后進行實時定量PCR，記錄Ct值（表3）。對表3中的數據進行兩因素方差分析，結果表明，不同溫度處理后，β-actin基因的表達量有顯著差異（F7，16=3.325，F7，16，0.05=2.889，P<0.05），而同一溫度處理在不同時間之間，β-actin基因的Ct值無顯著差異（F7，16，0.05=0.226 4，P<0.05）。對不同溫度處理的同一時間進行多重比較，結果顯示10 ℃ 1 h、15 ℃ 3 h、47 ℃ 5 h 的Ct值都顯著高于同一時間的其他溫度處理，而37 ℃和42 ℃處理無顯著差異，無論在兩個溫度之間還是不同時間之間都沒有顯著差異，表明小胸鱉甲β-actin基因對37 ℃和42 ℃不敏感，而較低的溫度和太高的溫度都影響β-actin基因的表達。

2.5 光滑鱉甲β-actin基因在不同溫度下的表達

將光滑鱉甲成蟲在5～47 ℃的不同溫度處理一定時間后，提取總RNA，反轉錄后進行實時定量PCR，檢測β-actin的表達，并以Ct值表示（表4）。結果表明，光滑鱉甲的β-actin在不同溫度條件下的表達有顯著不同（F5，36=4.817，F5，36，0.01=2.477，P<0.05），但在同一溫度處理的不同時間之間無顯著差異（F3，36=2.426，F3，36，0.05=3.259，P>0.05）。對不同溫度的相同時間之間進行多重比較可見，只有10 ℃ 1 h、5 h和42 ℃ 1 h的Ct值顯著低于其他處理，表明光滑鱉甲β-actin基因僅在10 ℃和42 ℃處理后表達水平有差異顯著。

為了在小胸鱉甲和光滑鱉甲之間比較β-actin基因在不同條件下表達的穩(wěn)定性，采用Ct值的變異系數進行分析。變異系數是標準差與平均數的比值，又稱標準差率，反映單位均值上的離散程度。結果顯示，除了37 ℃之外，光滑鱉甲β-actin基因表達的變異系數在不同溫度、不同溫差和季節(jié)性方面都小于小胸鱉甲的β-actin基因的變異系數（圖2），說明小胸鱉甲β-actin基因的表達在不同條件下有較大的波動。

3 結論與討論

荒漠環(huán)境對昆蟲的主要影響是溫度和干旱，由于昆蟲是變溫生物，因此昆蟲對溫度變化的響應是其生存適應的機制之一。為了確定今后開展荒漠昆蟲基因表達研究的內參基因，本研究對不同季節(jié)、不同溫差以及不同溫度下兩種昆蟲的β-actin基因表達的穩(wěn)定性進行了比較。研究結果表明，小胸鱉甲的β-actin基因在不同季節(jié)之間有顯著差異，在不同溫度條件下也有顯著差異，這表明小胸鱉甲β-actin基因的表達受溫度影響。與上述結果不一致的是，在本研究所設的溫差條件下，β-actin基因的表達無顯著差異，這可能是由于所設置的溫差是從10 ℃以上開始的，溫度變化程度還不足以引起小胸鱉甲β-actin表達變化。光滑鱉甲的β-actin基因在不同季節(jié)和溫差處理下無顯著差異，但在不同溫度條件下個別處理（37 ℃，1 h）有顯著升高，該溫度對光滑鱉甲不是脅迫溫度，不應該有波動，可能是實驗誤差所致。

季節(jié)變化包括溫度、降水和光照等綜合作用，由于荒漠地區(qū)溫度波動的季節(jié)性很大，所以溫度可能對昆蟲產生主要影響。本研究發(fā)現溫度對小胸鱉甲β-actin基因表達的影響大于對光滑鱉甲β-actin基因表達的影響，比較這兩個昆蟲在不同條件下β-actin基因表達的變異系數，可以看出，除了37 ℃以外，小胸鱉甲的變異系數均大于光滑鱉甲。究其原因可能與這兩種昆蟲的生活習性有關，小胸鱉甲避光喜陰，白天潛伏在沙土中，可能對溫度變化比較敏感，而光滑鱉甲喜光喜溫，白天在地面上活動，對高低溫的耐受性較強，對溫度變化的敏感性可能較低。某些生物的看家基因經高、低溫脅迫后仍然能穩(wěn)定表達，如對脈胞菌42 ℃處理不同時間后，tubulin基因的表達量不隨處理時間變化[11]?；哪ハx謝氏寬漠王熱激后不同恢復時間，其β-actin的表達量無明顯變化，且與未經熱激處理的對照相比無顯著差異[12]，這與光滑鱉甲β-actin基因對溫度的響應一致，因此β-actin基因可做為研究光滑鱉甲成蟲在不同溫度條件下的內參基因。

看家基因的表達受溫度影響在其他生物中也有報道。煙草經高溫脅迫后，葉內核蛋白基因和β-actin基因的表達量下降近10%，而擬南芥經高溫脅迫后，其葉內核蛋白基因和β-actin基因的表達量下降近50%，并且兩種基因在不同高溫下的表達量都存在一定程度的差異[13]。溫度對蛋白質表達的影響不僅表現在總蛋白上，也表現在對β-actin、tubulin等看家基因的表達上[11]。研究表明赤擬谷盜在真菌感染前后β-actin、α-tubulin和RPS6的表達都發(fā)生了變化[14]。所以，β-actin基因在不同昆蟲體內的穩(wěn)定性不同，在具體的試驗開始前需要選擇恰當的內參，需進一步探索在小胸鱉甲體內穩(wěn)定表達的基因。

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季節(jié)變化包括溫度、降水和光照等綜合作用，由于荒漠地區(qū)溫度波動的季節(jié)性很大，所以溫度可能對昆蟲產生主要影響。本研究發(fā)現溫度對小胸鱉甲β-actin基因表達的影響大于對光滑鱉甲β-actin基因表達的影響，比較這兩個昆蟲在不同條件下β-actin基因表達的變異系數，可以看出，除了37 ℃以外，小胸鱉甲的變異系數均大于光滑鱉甲。究其原因可能與這兩種昆蟲的生活習性有關，小胸鱉甲避光喜陰，白天潛伏在沙土中，可能對溫度變化比較敏感，而光滑鱉甲喜光喜溫，白天在地面上活動，對高低溫的耐受性較強，對溫度變化的敏感性可能較低。某些生物的看家基因經高、低溫脅迫后仍然能穩(wěn)定表達，如對脈胞菌42 ℃處理不同時間后，tubulin基因的表達量不隨處理時間變化[11]。荒漠昆蟲謝氏寬漠王熱激后不同恢復時間，其β-actin的表達量無明顯變化，且與未經熱激處理的對照相比無顯著差異[12]，這與光滑鱉甲β-actin基因對溫度的響應一致，因此β-actin基因可做為研究光滑鱉甲成蟲在不同溫度條件下的內參基因。

看家基因的表達受溫度影響在其他生物中也有報道。煙草經高溫脅迫后，葉內核蛋白基因和β-actin基因的表達量下降近10%，而擬南芥經高溫脅迫后，其葉內核蛋白基因和β-actin基因的表達量下降近50%，并且兩種基因在不同高溫下的表達量都存在一定程度的差異[13]。溫度對蛋白質表達的影響不僅表現在總蛋白上，也表現在對β-actin、tubulin等看家基因的表達上[11]。研究表明赤擬谷盜在真菌感染前后β-actin、α-tubulin和RPS6的表達都發(fā)生了變化[14]。所以，β-actin基因在不同昆蟲體內的穩(wěn)定性不同，在具體的試驗開始前需要選擇恰當的內參，需進一步探索在小胸鱉甲體內穩(wěn)定表達的基因。

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季節(jié)變化包括溫度、降水和光照等綜合作用，由于荒漠地區(qū)溫度波動的季節(jié)性很大，所以溫度可能對昆蟲產生主要影響。本研究發(fā)現溫度對小胸鱉甲β-actin基因表達的影響大于對光滑鱉甲β-actin基因表達的影響，比較這兩個昆蟲在不同條件下β-actin基因表達的變異系數，可以看出，除了37 ℃以外，小胸鱉甲的變異系數均大于光滑鱉甲。究其原因可能與這兩種昆蟲的生活習性有關，小胸鱉甲避光喜陰，白天潛伏在沙土中，可能對溫度變化比較敏感，而光滑鱉甲喜光喜溫，白天在地面上活動，對高低溫的耐受性較強，對溫度變化的敏感性可能較低。某些生物的看家基因經高、低溫脅迫后仍然能穩(wěn)定表達，如對脈胞菌42 ℃處理不同時間后，tubulin基因的表達量不隨處理時間變化[11]。荒漠昆蟲謝氏寬漠王熱激后不同恢復時間，其β-actin的表達量無明顯變化，且與未經熱激處理的對照相比無顯著差異[12]，這與光滑鱉甲β-actin基因對溫度的響應一致，因此β-actin基因可做為研究光滑鱉甲成蟲在不同溫度條件下的內參基因。

看家基因的表達受溫度影響在其他生物中也有報道。煙草經高溫脅迫后，葉內核蛋白基因和β-actin基因的表達量下降近10%，而擬南芥經高溫脅迫后，其葉內核蛋白基因和β-actin基因的表達量下降近50%，并且兩種基因在不同高溫下的表達量都存在一定程度的差異[13]。溫度對蛋白質表達的影響不僅表現在總蛋白上，也表現在對β-actin、tubulin等看家基因的表達上[11]。研究表明赤擬谷盜在真菌感染前后β-actin、α-tubulin和RPS6的表達都發(fā)生了變化[14]。所以，β-actin基因在不同昆蟲體內的穩(wěn)定性不同，在具體的試驗開始前需要選擇恰當的內參，需進一步探索在小胸鱉甲體內穩(wěn)定表達的基因。

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