大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與鑒定

李蘭蘭　陳玲肖　馬炬明

[摘要] 目的 建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）體外分離培養(yǎng)方法。方法 采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，繪制生長曲線，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、檢測細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物，并進(jìn)行成脂、成骨分化誘導(dǎo)。 結(jié)果 獲取的BMSCs形態(tài)呈均一成纖維細(xì)胞樣，并呈集落樣生長。生長曲線呈S形，細(xì)胞周期顯示86.02% P3代細(xì)胞為G0/G1期，保持活躍的擴(kuò)增能力。BMSCs 高表達(dá)CD44、CD90、低表達(dá)CD34、CD45。成脂誘導(dǎo)21 d后，可見細(xì)胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量紅染脂滴。成骨誘導(dǎo)21 d后，可見大量橘紅色礦化結(jié)節(jié)形成。結(jié)論 全骨髓貼壁培養(yǎng)法可成功有效地分離培養(yǎng)BMSCs。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；全骨髓貼壁法；鑒定

[中圖分類號] R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）01-0007-04

BMSCs具有高度增殖的能力、體外基因轉(zhuǎn)移效率高以及多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，使其成為組織工程、細(xì)胞替代治療等領(lǐng)域的首選種子細(xì)胞。但是骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞含量極低[3]，且其含量隨年齡增長而逐漸減少[4]，需經(jīng)體外分離、純化、擴(kuò)增為純度高、活力強(qiáng)、生物特性均一的間充質(zhì)干細(xì)胞才能滿足組織工程需求。實(shí)驗(yàn)旨在建立一套簡便有效的BMSCs原代培養(yǎng)方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性SD大鼠6只，4周齡，體質(zhì)量100 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 時(shí)間及地點(diǎn)

于2013年1～6月在中國人民解放軍第一一七醫(yī)院干細(xì)胞治療中心完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑

低糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/鏈霉素（吉諾生物），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（Gibco），anti-CD45、anti-CD90（BD），anti-CD34（Santa Cruz），anti-CD44（Abcam），細(xì)胞周期即時(shí)檢測試劑盒（凱基生物），成骨及成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液、茜素紅、油紅O（Cyagen公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 BMSCs的原代分離培養(yǎng) 用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后，置于75%的乙醇中浸泡7 min。無菌條件下分離股骨和脛骨，眼科剪切除兩端骨骺，用2.5 mL注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，待骨髓腔變白。充分吹打混勻，經(jīng)200目不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩過濾掉大的團(tuán)塊。收集細(xì)胞懸液于15 mL離心管中，400 g室溫離心5 min。離心后去上清，用5 mL完全培養(yǎng)液重懸，混勻，轉(zhuǎn)移至25 cm培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后首次全量換液，以后每3天換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長情況。

1.4.2 BMSCs的純化擴(kuò)增 待細(xì)胞融合至80%開始傳代，PBS沖洗。加入1.0 mL預(yù)熱的0.25%胰酶-0.02%EDTA，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，室溫孵育0.5 min，待鏡下胞質(zhì)回縮后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，并輕輕吹打培養(yǎng)瓶底。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，400 g室溫離心5 min，棄上清，完全培養(yǎng)液重懸，以1∶2或1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。此時(shí)細(xì)胞記為P1，以后每周換液2次，待細(xì)胞融合達(dá)80%后，重復(fù)上述步驟進(jìn)行傳代，依次記為P2、P3等。

1.4.3 BMSCs 的生長曲線測定 取生長良好的第3代細(xì)胞，0.25%胰酶-0.02%EDTA常規(guī)消化，以2×104/mL 接種于24孔板，每天取3孔消化計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)3次，計(jì)算均值，連續(xù)8 d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，描繪生長曲線。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 取生長狀態(tài)良好的第3代BMSCs，常規(guī)消化，制成單細(xì)胞懸液，將200 μL 4℃預(yù)冷的乙醇與細(xì)胞懸液均勻固定，室溫孵育10 min，加入RnaseA 200 μL，盡量避免產(chǎn)生氣泡，室溫孵育10 min，加入碘化丙啶300 μL，室溫避光孵育15 min，上機(jī)檢測。

1.4.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記 待第3代BMSCs融合至80%，常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，分裝至EP管中。于待檢測的樣本中各加入100 μL PBS重懸，分別加入CD34，CD44，CD45，CD90一抗及同型對照10 μL，充分混勻，室溫避光孵育30 min后，用PBS洗滌2次，400 g，室溫離心5 min，棄上清，每測試管加500 μL PBS，充分混勻，流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.6 成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 待培養(yǎng)的P3 BMSCs生長至80%融合，常規(guī)消化，以2×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板，每3天換新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，待細(xì)胞完全融合后，實(shí)驗(yàn)組加入2 mL成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液A，3 d后將分化誘導(dǎo)液換為成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液B，1 d后再換回成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液A進(jìn)行誘導(dǎo)，如此循環(huán)3～5次后，用成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液B繼續(xù)維持7 d，每3天進(jìn)行換液，對照組加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長情況，21 d后進(jìn)行油紅O染色。

1.4.7 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 待培養(yǎng)的P3 BMSCs生長至80%融合，常規(guī)消化，以3×104/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板（培養(yǎng)皿底部有明膠包被），常規(guī)培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞達(dá)50%～70%融合，實(shí)驗(yàn)組加入2 mL成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，對照組加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每3天換液1次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長情況。成骨誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行茜素紅染色。endprint

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

剛接種時(shí)細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，呈圓形，大小不一，折光性較強(qiáng)。48 h首次換液后可見大量細(xì)胞貼壁，形態(tài)不一，部分伸出偽足。三四天貼壁細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞偽足增長呈短梭形。五六天細(xì)胞增殖迅速呈克隆樣生長的集落。八九天左右細(xì)胞形態(tài)基本為長梭型細(xì)胞，縱軸相互平行排列，一般可達(dá)到80%的細(xì)胞融合狀態(tài)。傳代細(xì)胞接種4 h后基本完全貼壁，很快鋪展。細(xì)胞增殖速度較原代快，呈均勻分布的紡錘形，五六天即可傳代，見圖1。

圖1 P3 BMSCs培養(yǎng)5 d，×100

2.2 BMSCs的生長曲線

接種后，BMSCs經(jīng)過1～2 d的潛伏適應(yīng)期后進(jìn)入對數(shù)增殖期，第7天達(dá)頂點(diǎn)，隨后進(jìn)入平臺期（平均細(xì)胞計(jì)數(shù)依次為2、2.22、2.44、3.33、5.67、7、8.22、8.11×104/孔），生長曲線呈S形，符合正常細(xì)胞的生長特性，見圖2。

2.3 細(xì)胞生長周期

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，第3代BMSCs中G0/G1期細(xì)胞為86.02%，G2期細(xì)胞為5.41%，S期細(xì)胞為4.90%，見圖3。

圖3 P3 BMSCs細(xì)胞周期

2.4 BMSCs表面標(biāo)記物的表達(dá)

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞CD44、CD90陽性率分別為96.2%、97.9%，CD34、CD45陽性率分別為0.3%、0.9%，驗(yàn)證此細(xì)胞為BMSCs，純度較高，見圖4。

2.5 誘導(dǎo)分化鑒定

成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞逐漸由梭形變?yōu)閳A形，油紅O染色可見橙紅色折光性強(qiáng)的脂滴，呈圓形，定位于胞漿，見圖5A。成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，局部細(xì)胞呈重疊生長，染色后可見大量橘紅色致密結(jié)節(jié)形成，見圖5B。對照組均呈陰性染色。

A：實(shí)驗(yàn)組油紅O染色；B：實(shí)驗(yàn)組茜素紅染色

圖5 多向分化功能鑒定（×100）

3 討論

BMSCs是一種存在于骨髓間質(zhì)內(nèi)的非造血系成體干細(xì)胞，可以自體取材，具有多向分化潛能，無倫理學(xué)限制。目前分離方法主要包括密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細(xì)胞儀分離法及免疫磁珠分離法[5]。后兩種方法分離的細(xì)胞純度較高，但價(jià)格昂貴，對細(xì)胞活性有較大影響，目前應(yīng)用較少。楊麗等[6]研究發(fā)現(xiàn)，全骨髓貼壁法比密度梯度離心法更加簡單實(shí)用，降低了離心對細(xì)胞的損害，分離的細(xì)胞貼壁時(shí)間短，增殖快?？紤]離心過程中，丟失了促進(jìn)BMSCs貼壁的一些生長因子及促黏附物質(zhì)，改變了骨髓中原有的微環(huán)境，所用的分離液對細(xì)胞有一定的毒性作用，影響細(xì)胞的活性。林楚偉[7]等證實(shí)全骨髓貼壁加差速傳代法分離培養(yǎng)的BMSCs生長增殖活力強(qiáng)于密度梯度離心法。張君紅[8]等觀察到使用SD雌性大鼠分離后的細(xì)胞懸液含有較多脂滴，貼壁細(xì)胞不牢固且傳代困難，可能與雌、雄性大鼠體內(nèi)的雌、雄激素等水平存在差異有關(guān)。

全骨髓貼壁法是利用BMSCs對塑料底的貼附性，定期換液去除懸浮生長的造血系細(xì)胞，進(jìn)行分選純化。利用BMSCs較巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等易于消化的特點(diǎn)，嚴(yán)格掌握消化酶的量及消化時(shí)間，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即消化，輕柔吹打，盡量避免出現(xiàn)氣泡。注意傳代時(shí)的細(xì)胞融合程度，避免細(xì)胞接觸抑制，延緩細(xì)胞老化的時(shí)間。BMSCs生長時(shí)密度依賴性極強(qiáng)[9]，注意傳代細(xì)胞的種植密度。首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為采用形態(tài)學(xué)觀察、增殖能力、表面標(biāo)志及多向分化的特點(diǎn)進(jìn)行逆向推斷是否為BMSCs[10]。大量的研究表明BMSCs表達(dá)CD29、CD44、CD71、CD73、CD90和CD105等表面標(biāo)志，不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志如CD14、CD34、CD45、CD106等[11]。本方法所培養(yǎng)細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞，呈長梭形、紡錘形等成纖維細(xì)胞形態(tài)，大小比較均一，呈“漩渦狀”生長。細(xì)胞生長曲線呈S形，經(jīng)歷潛伏適應(yīng)期、對數(shù)增殖期、平臺期，符合正常細(xì)胞的生長特性。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示大多數(shù)BMSCs處于靜止期，保持自我更新和增殖潛能，約10%處于功能期，具有強(qiáng)大的分化增殖能力。高表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD44、CD90，低表達(dá)CD34、CD45，能向成骨、成脂分化，具有多向分化潛能，符合國際細(xì)胞治療學(xué)會間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會提出的鑒定動物來源BMSCs的三條最低標(biāo)準(zhǔn)，為下一步探討B(tài)MSCs逆轉(zhuǎn)肝纖維化的機(jī)制提供功能穩(wěn)定的種子細(xì)胞。

盡管對間充質(zhì)干細(xì)胞的研究已很深入，但其缺乏特異性表型標(biāo)志物，如何準(zhǔn)確簡便地鑒定BMSCs以及其體外分化誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-08-23）endprint

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