磷酸肌酸鈉對(duì)大鼠肢體缺血再灌注心肌損傷的影響

袁夢(mèng)　王丙瓊　丁明

[摘要] 目的 研究磷酸肌酸鈉對(duì)肢體缺血再灌注后心肌損傷有無(wú)保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法 選取SD大鼠24只，將其隨機(jī)分為三組：①空白對(duì)照組（C組）；②肢體缺血再灌注組（LIR組）；③磷酸肌酸鈉組（P組），每組8只。分別檢測(cè)血清肌鈣蛋白I（c-TnI）、磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB），心肌組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、鈣調(diào)蛋白（CaM）的含量，并且觀察各組心肌組織的病理變化。 結(jié)果 LIR組與C組相比，血清c-TnI、CK-MB及心肌組織中MDA、CaM的含量都顯著增高，而SOD含量明顯下降，心肌組織有明顯的病理變化；P組與LIR組相比，SOD活性相對(duì)升高，c-TnI、CK-MB、MDA、CaM含量相對(duì)降低，病理變化有所改善。 結(jié)論 肢體缺血再灌注可誘發(fā)心肌組織的損傷；外源性磷酸肌酸鈉可減少肢體缺血再灌注心肌組織內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，維持細(xì)胞內(nèi)鈣平衡，起到保護(hù)心肌的作用。

[關(guān)鍵詞] 磷酸肌酸鈉；肢體缺血再灌注；心肌損傷；氧自由基

[中圖分類(lèi)號(hào)] R-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）01-0001-03

臨床上的肢體創(chuàng)傷、斷肢再植、手術(shù)使用止血帶時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、血栓形成、擠壓綜合征等均可導(dǎo)致肢體缺血再灌注損傷。近年來(lái)對(duì)肢體缺血再灌注（limb ischemia reperfusion，LIR）的研究發(fā)現(xiàn)[1]，LIR不僅單純導(dǎo)致肢體的損傷，還可誘發(fā)心、肺、腦、肝、腎等遠(yuǎn)隔器官的損傷，甚至可引發(fā)多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。LIR導(dǎo)致心臟損傷的機(jī)制現(xiàn)在研究表明主要是通過(guò)氧自由基、中性粒細(xì)胞（PMNs）介導(dǎo)的[2]。如何改善和避免LIR導(dǎo)致的損傷已經(jīng)引起了人們的關(guān)注。磷酸肌酸鈉作為一種能量合劑，具有抗氧化、清除氧自由基、改善微循環(huán)等及維持細(xì)胞內(nèi)鈣平衡的作用。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立肢體缺血再灌注繼發(fā)心臟損傷的模型，探討外源性磷酸肌酸鈉對(duì)其的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和分組

健康雄性SD大鼠24只，體重200～230 g，由濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為三組：C組、LIR組、P組，每組8只。MDA、SOD、CaM試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所。注射用磷酸肌酸鈉購(gòu)自北京利祥制藥有限公司。

1.2 動(dòng)物模型制備

大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。用10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉。用橡皮圈環(huán)扎大鼠雙后肢根部，阻斷大鼠雙下肢血流，環(huán)扎后雙下肢不能觸及動(dòng)漫波動(dòng)趾掌蒼白發(fā)涼。雙下肢環(huán)扎4 h后，剪斷橡皮圈，恢復(fù)血流灌注4 h，動(dòng)脈搏動(dòng)恢復(fù)，雙下肢逐漸變紅變暖，建模成功。P組于再灌注前5 min腹腔注射磷酸肌酸鈉（150 mg/kg）；LIR組再灌注前注射同等劑量的生理鹽水；而C組雙下肢不環(huán)扎只注射同等劑量的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本的采集及檢測(cè)

再灌注4 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉，開(kāi)腹于下腔靜脈取血3～5 mL，裝于促凝管，放置1 h凝固后3 000 r/min離心15 min，取上清液即血清，裝于EP管中冰箱-20℃保存；取血后迅速開(kāi)胸，取出心臟。

1.4 觀察指標(biāo)

①檢測(cè)血清中c-TnI、CK-MB的含量；②將心尖組織切下，生理鹽水沖洗干凈，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色。光鏡下觀察心肌的病理變化。③去心肌組織400 mg，制成10%心肌組織勻漿，檢測(cè)心肌組織中MDA、SOD、CaM的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清c-TnI、CK-MB含量

與C組相比，LIR組和P組血清c-TnI、CK-MB含量均增高（P < 0.01）；與LIR組比較，P組血清c-TnI、CK-MB含量則下降（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組心肌中MDA、SOD、CaM的變化

LIR組、P組分別與C組相比，MDA、CaM含量都升高，SOD活性降低（P < 0.05）；P組相較于LIR組，MDA、CaM含量降低，SOD活性增高（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組心肌中MDA、SOD、CaM含量的比較（x±s）

注：與C組比較，★P < 0.01，☆P < 0.05；與LIR組比較，○P < 0.05

2.3 心肌組織形態(tài)學(xué)變化

光鏡下觀察，C組可見(jiàn)大鼠心肌排列整齊，肌間隙未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；LIR組可見(jiàn)部分心肌纖維斷裂，肌間隙增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張，肌間隙內(nèi)有紅細(xì)胞漏出，心肌細(xì)胞腫脹，甚至可見(jiàn)心肌壞死；P組心肌的病理?yè)p傷有所改善，但未恢復(fù)正常。見(jiàn)封三圖1～3。

3 討論

缺血再灌注損傷是一個(gè)多因素參與、多機(jī)制損傷的過(guò)程，其中關(guān)鍵在于能量代謝障礙、鈣離子超載、氧自由基生成、白細(xì)胞的激活等方面[3]。而由肢體缺血再灌注導(dǎo)致的遠(yuǎn)隔器官的損傷也越來(lái)越得到大家的重視。近年來(lái)研究[4-6]結(jié)果表明，LIR后心肌組織中MDA、髓過(guò)氧化物酶（MPO）、TNF-α、IL-10水平、Bax表達(dá)、凋亡指數(shù)（AI）明顯升高，SOD活性降低，左心室功能降低，證明了LIR可引起心肌的氧化應(yīng)激反應(yīng)、白細(xì)胞聚集、細(xì)胞凋亡等各方面的損傷。

MDA和SOD這對(duì)指標(biāo)反映體內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)，間接反映了氧自由基產(chǎn)生的情況。MDA是氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終末代謝產(chǎn)物，其含量反映了體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映了組織內(nèi)自由基的水平。SOD是清除超氧陰離子Oˉ2的專(zhuān)一歧化酶，其活性變化可反映體內(nèi)抗氧化功能的情況，是一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，避免氧自由基的儲(chǔ)積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LIR使心肌組織中MDA含量顯著升高，SOD活性下降，說(shuō)明肢體缺血再灌注后，氧在黃嘌呤氧化酶的作用下釋放大量氧自由基，引發(fā)心肌組織的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，破壞心肌細(xì)胞膜的完整性，致使細(xì)胞的功能代謝發(fā)生障礙。c-TnI、CK-MB是心肌損傷的常用指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于對(duì)心臟疾病的診斷中，特別是c-TnI具有診斷窗口寬，診斷閾值明確及檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，成為了判斷心肌損傷的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。P組的情況有所改善，說(shuō)明磷酸肌酸鈉可起到清除自由基、抗氧化的作用。endprint

鈣調(diào)蛋白（CaM，也稱(chēng)鈣調(diào)素），是一種細(xì)胞內(nèi)最重要的鈣受體蛋白，可參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)多種Ca2+依賴(lài)的生理生化反應(yīng)[8]。CaM通過(guò)與Ca2+特異性結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物，調(diào)節(jié)Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+的攝取和釋放[9]。肢體缺血再灌注后導(dǎo)致心肌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+迅速增多，與CaM結(jié)合，使其活性升高，可直接激活由Ca2+-CaM調(diào)節(jié)的多種代謝酶，如一氧化氮合酶（NOS）、CaM依賴(lài)性蛋白激酶（CaMK）、磷酸二酯酶、腺苷酸環(huán)化酶（AC）等，這些酶均可引起心肌細(xì)胞的代謝障礙，進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜、線粒體等的功能，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+、組織內(nèi)自由基進(jìn)一步增多，形成心肌損傷的惡性循環(huán)。外源性磷酸肌酸鈉能被機(jī)體組織迅速吸收，直接釋放高能磷酸鍵，合成ATP，迅速補(bǔ)充機(jī)體能量，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定細(xì)胞膜，增加缺氧組織對(duì)氧的利用，減輕缺氧組織的損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，LIR組大鼠心肌組織內(nèi)CaM含量明顯升高，而P組相對(duì)減少，說(shuō)明給予外源性磷酸肌酸鈉后，為心肌細(xì)胞提供ATP，穩(wěn)定了細(xì)胞膜，減少了Ca2+細(xì)胞內(nèi)流，改善了心肌細(xì)胞代謝障礙，減輕了心肌組織的病理?yè)p傷。

綜上所述，LIR可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的自由基大量產(chǎn)生、白細(xì)胞大量激活“呼吸爆發(fā)”，誘發(fā)遠(yuǎn)隔器官心臟的損傷；再灌注前給予外源性磷酸肌酸鈉，可改善LIR誘發(fā)的心肌損傷，可能的機(jī)制是磷酸肌酸鈉可為心肌細(xì)胞提供能量，為心肌細(xì)胞膜上的Ca2+交換泵提供ATP，減少Ca2+內(nèi)流，降低CaM的活性，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡，從而起到減少自由基生成、抗氧化、防止鈣超載、改善微循環(huán)等藥理作用。臨床上對(duì)肢體缺血再灌注導(dǎo)致心肌損傷的程度及應(yīng)用磷酸肌酸鈉的意義還有待證實(shí)。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2013-09-10）endprint

鈣調(diào)蛋白（CaM，也稱(chēng)鈣調(diào)素），是一種細(xì)胞內(nèi)最重要的鈣受體蛋白，可參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)多種Ca2+依賴(lài)的生理生化反應(yīng)[8]。CaM通過(guò)與Ca2+特異性結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物，調(diào)節(jié)Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+的攝取和釋放[9]。肢體缺血再灌注后導(dǎo)致心肌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+迅速增多，與CaM結(jié)合，使其活性升高，可直接激活由Ca2+-CaM調(diào)節(jié)的多種代謝酶，如一氧化氮合酶（NOS）、CaM依賴(lài)性蛋白激酶（CaMK）、磷酸二酯酶、腺苷酸環(huán)化酶（AC）等，這些酶均可引起心肌細(xì)胞的代謝障礙，進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜、線粒體等的功能，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+、組織內(nèi)自由基進(jìn)一步增多，形成心肌損傷的惡性循環(huán)。外源性磷酸肌酸鈉能被機(jī)體組織迅速吸收，直接釋放高能磷酸鍵，合成ATP，迅速補(bǔ)充機(jī)體能量，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定細(xì)胞膜，增加缺氧組織對(duì)氧的利用，減輕缺氧組織的損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，LIR組大鼠心肌組織內(nèi)CaM含量明顯升高，而P組相對(duì)減少，說(shuō)明給予外源性磷酸肌酸鈉后，為心肌細(xì)胞提供ATP，穩(wěn)定了細(xì)胞膜，減少了Ca2+細(xì)胞內(nèi)流，改善了心肌細(xì)胞代謝障礙，減輕了心肌組織的病理?yè)p傷。

綜上所述，LIR可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的自由基大量產(chǎn)生、白細(xì)胞大量激活“呼吸爆發(fā)”，誘發(fā)遠(yuǎn)隔器官心臟的損傷；再灌注前給予外源性磷酸肌酸鈉，可改善LIR誘發(fā)的心肌損傷，可能的機(jī)制是磷酸肌酸鈉可為心肌細(xì)胞提供能量，為心肌細(xì)胞膜上的Ca2+交換泵提供ATP，減少Ca2+內(nèi)流，降低CaM的活性，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡，從而起到減少自由基生成、抗氧化、防止鈣超載、改善微循環(huán)等藥理作用。臨床上對(duì)肢體缺血再灌注導(dǎo)致心肌損傷的程度及應(yīng)用磷酸肌酸鈉的意義還有待證實(shí)。

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鈣調(diào)蛋白（CaM，也稱(chēng)鈣調(diào)素），是一種細(xì)胞內(nèi)最重要的鈣受體蛋白，可參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)多種Ca2+依賴(lài)的生理生化反應(yīng)[8]。CaM通過(guò)與Ca2+特異性結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物，調(diào)節(jié)Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+的攝取和釋放[9]。肢體缺血再灌注后導(dǎo)致心肌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+迅速增多，與CaM結(jié)合，使其活性升高，可直接激活由Ca2+-CaM調(diào)節(jié)的多種代謝酶，如一氧化氮合酶（NOS）、CaM依賴(lài)性蛋白激酶（CaMK）、磷酸二酯酶、腺苷酸環(huán)化酶（AC）等，這些酶均可引起心肌細(xì)胞的代謝障礙，進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜、線粒體等的功能，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+、組織內(nèi)自由基進(jìn)一步增多，形成心肌損傷的惡性循環(huán)。外源性磷酸肌酸鈉能被機(jī)體組織迅速吸收，直接釋放高能磷酸鍵，合成ATP，迅速補(bǔ)充機(jī)體能量，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定細(xì)胞膜，增加缺氧組織對(duì)氧的利用，減輕缺氧組織的損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，LIR組大鼠心肌組織內(nèi)CaM含量明顯升高，而P組相對(duì)減少，說(shuō)明給予外源性磷酸肌酸鈉后，為心肌細(xì)胞提供ATP，穩(wěn)定了細(xì)胞膜，減少了Ca2+細(xì)胞內(nèi)流，改善了心肌細(xì)胞代謝障礙，減輕了心肌組織的病理?yè)p傷。

綜上所述，LIR可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的自由基大量產(chǎn)生、白細(xì)胞大量激活“呼吸爆發(fā)”，誘發(fā)遠(yuǎn)隔器官心臟的損傷；再灌注前給予外源性磷酸肌酸鈉，可改善LIR誘發(fā)的心肌損傷，可能的機(jī)制是磷酸肌酸鈉可為心肌細(xì)胞提供能量，為心肌細(xì)胞膜上的Ca2+交換泵提供ATP，減少Ca2+內(nèi)流，降低CaM的活性，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡，從而起到減少自由基生成、抗氧化、防止鈣超載、改善微循環(huán)等藥理作用。臨床上對(duì)肢體缺血再灌注導(dǎo)致心肌損傷的程度及應(yīng)用磷酸肌酸鈉的意義還有待證實(shí)。

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（收稿日期：2013-09-10）endprint