高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)血紅素加氧酶—1減輕大鼠腦出血后腦水腫

施振華 裘五四 王衛(wèi)民 姜啟周 秦智勇

【摘要】目的 研究血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）在高壓氧預(yù)處理（hypeRbaic oxygen pReconditioning， HBOP）減輕大鼠腦出血后腦水腫形成過程中的作用。方法 本實(shí)驗(yàn)共選用54只雄性SpRadgue-Dawley大鼠，體質(zhì)量300～350 g，分為兩部分：第1部分，6只大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為兩組（n=3），分別接受高壓氧預(yù)處理（HBOP組）或假預(yù)處理（假預(yù)處理組）；預(yù)處理結(jié)束24 h后處死，取基底節(jié)組織，采用WesteRn blot法檢測(cè)HO-1蛋白含量。第2部分：48只SD大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為四組（n=12），各組大鼠在預(yù)處理前腹腔內(nèi)置入含HO-1抑制劑鋅原卟啉Ⅸ（zinc pRotopoRphyRin Ⅸ， ZnPPⅨ）的緩泵（0，01 mg/kg）（HBOP+ZnPP組、假預(yù)處理+ZnPP組）或含2 mL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）載體溶劑的緩釋泵作為對(duì)照（HBOP+DMSO組、假預(yù)處理+DMSO組），隨后接受高壓氧預(yù)處理（HBOP組+ZnPP組，HBOP+DMSO組）或假預(yù)處理（假預(yù)處理+ZnPP組，假預(yù)處理+DMSO組）。預(yù)處理結(jié)束24 h后，立體定向基底節(jié)內(nèi)注射自體股動(dòng)脈血100 μL建立基底節(jié)腦出血模型，72 h后處死，采用干濕質(zhì)量法測(cè)定腦組織水含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Stata 7，0軟件進(jìn)行成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)。結(jié)果 HBOP組大鼠基底節(jié)組織內(nèi)HO-1蛋白含量與假預(yù)處理相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0，05）；HBOP+DMSO組大鼠血腫同側(cè)基底節(jié)組織水含量為（81，4±0，9）%，顯著低于假預(yù)處理+DMSO組（82，6±0，8）%（P<0，05），但大鼠接受高壓氧預(yù)處理同時(shí)腹腔內(nèi)給予HO-1抑制劑ZnPPⅨ則抵消了HBOP減輕腦出血后腦水腫的效應(yīng)[（82，8±0，9）% vs.（82，6±0，7）% （P>0，05）]。 結(jié)論 高壓氧預(yù)處理顯著減輕大鼠腦出血后腦水腫，其作用機(jī)制與其上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】高壓氧；預(yù)處理；大鼠；腦出血；腦水腫；血紅素加氧酶-1；鋅原卟啉Ⅸ

Hemeoxgenase-1 mediates the pRotective effect of hypeRbaRic oxygen pReconditioning against the bRain edema afteR expeRimental hemoRRhage in Rats Shi Zhenhua，Qiu Wusi，Wang Weimin，Jiang Qizhou，Qin Zhiyong. DepaRtment of NeuRosuRgeRy，The Affiliated Hospital of Hangzhou NoRmal UniveRsity，Hangzhou 310015，China

CoRResponding authoR： Qin Zhiyong， Email： wisdomqin@vip，163，com

【AbstRact】Objective To investigate the Role of Heme oxygenase-1 in the effect of hypeRbaRic oxygen pReconditioning （HBOP） against the bRain edema foRmation afteR expeRimental intRaceRebRal hemoRRhage in Rats.Methods The study was caRRied out by animal expeRiment in two steps by using 54 SpRadgue-Dawley Rats weighting fRom 300-350 g. In the fiRst step， Rats weRe tReated with HBOP （HBOP gRoup， n=3） oR with sham pRe-conditioning （Sham pRe-conditioning gRoup， n=3）. All the Rats weRe sacRificed 24 h afteR the pRe-conditioning， and basal ganglion of bRain tissue was taken foR detect HO-1 level by using westeRn blot analysis. In the second step， Rats weRe divided into 4 gRoups （n=12 in each gRoup）： HBOP+ZnPP gRoup， in which Rats had a micRo-pump intRa-peRitoneally implanted containing a specific HO-1 inhibitoR ZnPPⅨ（Zinc pRotopoRphyRin IX， 0，01 mg/kg）， Sham pRe-conditioning+Znpp gRoup， HBOP+DMSO gRoup， in which Rats with a intRa-peRitoneal micRo-pump containing 2 mL Dimethyl sulfoxide （DMSO， a solvent vehicle） and Sham pRe-conditioning+DMSO gRoup befoRe HBOP. At 24 houRs afteR the pRe-conditioning， Rats Received an infusion of 100 μL autologous blood into the caudate nucleus to foRm a simulated intRa-ceRebRum hemoRRhage （ICH）， and weRe sacRificed 72 h lateR foR bRain wateR content measuRements. All data weRe analyzed by using Stata 7，0 softwaRe and statistical analyses weRe caRRied out by two-tailed Student t test.Results CompaRed with the Sham pRe-conditioning gRoup， the HBOP gRoup had significant higheR level of HO-1. CompaRed with the Sham pRe-conditioning+DMSO gRoup， the HBOP+DMSO gRoup had a significant loweR level of wateR content in the ipsilateRal basal ganglion[（81，4±0，9）% vs. （82，6±0，8）% （P<0，05）]， howeveR， peRitoneal infusion of ZnPPⅨ befoRe HBOP abolished HBOP-induced pRotection against bRain edema foRmation afteR expeRimental ICH[（82，8±0，9）% vs.（82，6±0，7）% （P>0，05）]. Conclusions HypeRbaRic oxygen pReconditioning attenuate bRain edema foRmation afteR expeRimental ICH in Rats， and this pRotection is attRibuted to the activation of HO-1.

【Key woRds】HypeRbaRic oxygen；PReconditioning；Rat；IntRaceRebRal hemoRRhage；BRain edema；Heme oxygenase-1；Zinc pRotopoRphyRin

腦出血（intRaceRebRal hemoRRhage， ICH）后腦水腫程度是判斷腦出血患者臨床預(yù)后的重要因素，目前臨床上對(duì)腦出血后腦水腫的治療方法有限。Qin等[1]研究首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道高壓氧預(yù)處理（hypeRbaRic oxygen pReconditioning， HBOP）顯著減輕SD大鼠ICH 24 h后腦水腫。筆者前期實(shí)驗(yàn)研究顯示，HBOP顯著減輕大鼠ICH 72 h后腦水腫，減輕了血腫周圍炎癥反應(yīng)并延緩了神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。 血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）是體內(nèi)催化血紅素分解的限速酶，是一種應(yīng)激蛋白（熱休克蛋白32）[3]。HO-1在ICH后腦水腫發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，ICH后迅速上調(diào)表達(dá)[4]，HO-1特異性抑制劑能顯著減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICH后及腦內(nèi)注射血紅蛋白降解產(chǎn)物后的腦水腫[5-7]。研究表明，HO-1的上調(diào)在HBOP以及缺血后處理誘導(dǎo)缺血-再灌注損傷耐受現(xiàn)象中起著重要的保護(hù)性作用[8，9]。HO-1是否也參與了HBOP誘導(dǎo)的ICH后腦保護(hù)性作用機(jī)制尚不明確，因此本實(shí)驗(yàn)通過觀察HBOP對(duì)大鼠基底節(jié)組織內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)的影響以及HO-1特異性抑制劑鋅原卟啉Ⅸ（zinc pRotopoRphyRin，ZnPPⅨ）對(duì)HBOP誘導(dǎo)的ICH后減輕腦水腫效應(yīng)的影響，從而探討HO-1在HBOP減輕大鼠腦出血后腦水腫過程中的作用，旨在進(jìn)一步研究HBOP對(duì)大鼠ICH后腦保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1，1 動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)選用雄性SpRadgue-Dawley大鼠共54只，體質(zhì)量300～350 g，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。實(shí)驗(yàn)分為兩部分，第1部分：6只大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為兩組（n=3），分別接受高壓氧預(yù)處理（HBOP組）或假預(yù)處理（假預(yù)處理組）。預(yù)處理結(jié)束24 h后，斷頭取基底節(jié)腦組織，采用WesteRn blot法檢測(cè)HO-1蛋白的含量。第2部分：48只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為四組（n=12），大鼠在預(yù)處理前腹腔內(nèi)置入含HO-1抑制劑ZnPPⅨ的緩釋泵（HBOP+ZnPP組、假預(yù)處理+ZnPP組）或含2 mL DMSO載體溶劑緩釋泵作為對(duì)照（HBOP+DMSO組、假預(yù)處理+DMSO組），隨后大鼠接受高壓氧預(yù)處理（HBOP+ZnPP組、HBOP+DMSO組）或假預(yù)處理（假預(yù)處理+ZnPP組、假預(yù)處理+DMSO組）；預(yù)處理結(jié)束24 h后，基底節(jié)內(nèi)注射自體股動(dòng)脈血100 μL建立腦出血模型，腦出血72 h后斷頭取腦，采用干濕質(zhì)量法測(cè)定腦組織水含量。

1，2 高壓氧預(yù)處理與假預(yù)處理方案

大鼠HBOP和假預(yù)處理方案按Qin等[1，10]研究所采用的方案。HBOP：3 個(gè)絕對(duì)大氣壓（1個(gè)絕對(duì)大氣壓≈100 kPa），100% O2，每次1 h，1次/d ，連續(xù)5 d；假預(yù)處理：1個(gè)絕對(duì)大氣壓，空氣， 每次1 h，1次/d ，連續(xù)5 d。本實(shí)驗(yàn)中具體方法為：HBOP組、HBOP+ZnPP組、HBOP+DMSO組大鼠置入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用高壓氧艙（DWC150/300型，中國上海七零一所楊園高壓氧艙有限公司）內(nèi)，以醫(yī)用純氧作氣源，15 min內(nèi)勻速加壓至3個(gè)絕對(duì)大氣壓。通過調(diào)整進(jìn)出口氣流量維持氧艙內(nèi)壓力平穩(wěn)，并維持艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)99%以上，持續(xù)1 h后于30 min內(nèi)均勻降壓至1個(gè)絕對(duì)大氣壓。每天1次，連續(xù)5 d。假預(yù)處理組、假預(yù)處理+ZnPP組、假預(yù)處理+DMSO組大鼠也置入高壓氧艙內(nèi)，只暴露于空氣中，1 次/d，每天1 h，連續(xù)5 d。

1，3 大鼠腦組織內(nèi)HO-1蛋白的WesteRn blot檢測(cè)

HBOP組大鼠與假預(yù)處理組大鼠第5次預(yù)處理結(jié)束24 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國上海）深度麻醉后，經(jīng)左心室內(nèi)灌注4 ℃的0，1 mmol/L PBS 直至右心室流出無色液體止。斷頭取腦，于穿刺點(diǎn)前后作一冠狀位斷層，將大鼠基底節(jié)組織樣本浸沒于0，5 mL WesteRn blot樣本緩沖液（62，5 mmol/L TRis-HCl，pH 6，8，2，3% SDS，10% 甘油，5%β-巰基乙醇），超聲乳化后備用。從各組樣本中取出蛋白含量為50 mg的樣本置于95 ℃下水浴煮5 min變性后，將樣本置于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后將凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜在脫脂奶粉中封閉后，一抗以兔抗鼠HO-1抗體（1∶ 2000稀釋，Cell Signaling Technology）孵育過夜，隨后二抗以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ig-G抗體（Bio-Rad laboRatoRy ，USA）孵育。抗原抗體復(fù)合物通過ECL發(fā)光體系統(tǒng)檢測(cè)（AmeRsham），最終曝光于光感膠片（X-OMAT， Kodak），蛋白條帶的相對(duì)濃度采用NIH Image 軟件（ 版本：1，62，NIH）圖像分析軟件處理。

1，4 HO-1抑制劑ZnPPⅨ緩釋泵及載體溶劑DMSO液緩釋泵腹腔內(nèi)置入

HBOP+ZnPP組及假預(yù)處理+ZnPP組大鼠在接受預(yù)處理前腹腔內(nèi)置入含ZnPPⅨ（0，01 mg/kg）（Sigma公司，美國）的緩釋泵。HBOP+DMSO組及假預(yù)處理+DMSO組大鼠則在接受預(yù)處理前腹腔內(nèi)置入含 2 mL DMSO載體溶劑（Sigma公司，美國）緩釋泵作為對(duì)照。微泵持續(xù)5 d與預(yù)處理持續(xù)時(shí)間相同。

1，5 大鼠基底節(jié)腦出血模型的建立

大鼠腦出血模型采用較成熟的基底節(jié)自體股動(dòng)脈血注射法，如文獻(xiàn)[3，10-11]所述的方法。本實(shí)驗(yàn)具體方法為：HBOP+ZnPP組、假預(yù)處理+ZnPP組、HBOP+DMSO組、假預(yù)處理+DMSO組大鼠在第5次HBOP或假預(yù)處理結(jié)束24 h后，1%戊巴比妥鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海，中國）腹腔注射麻醉（45 mg/kg），頭部及股部備皮，安爾碘消毒，頭部固定于小動(dòng)物立體定向儀（ALC-H型，上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司，中國上海）上，切開右股部皮膚，顯微分離暴露股動(dòng)脈，置入24 G靜脈留置針以備取血。應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用恒溫系統(tǒng)（ALC-HTP型，上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，中國上海）控制肛門溫度為37～37，5 ℃。頭部正中切開暴露冠狀縫及中線矢狀縫，在右側(cè)冠狀縫上距中線旁開3，5 mm處，顱骨鉆孔直徑約1 mm。用1 mL注射器取自體股動(dòng)脈血，連接26 G注射用針頭，自顱骨鉆孔處垂直進(jìn)針，自硬腦膜起深度為5，5 mm，在10 min內(nèi)勻速向大鼠基底節(jié)內(nèi)推注100 μL自體股動(dòng)脈血，留針5 min后緩慢退針。骨臘封閉顱骨孔，絲線縫合皮膚。在基底節(jié)注入血腫前監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血pH、PaO2、PaCO₂、血球壓積、血糖。

1，6 大鼠腦組織水含量測(cè)定

腦出血模型制作72 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國上海）深麻醉（60 mg/kg），快速斷頭完整取出腦組織，以皮層穿刺點(diǎn)為中心作一冠狀位斷層（層厚約3 mm），該斷層腦組織再沿中線分離為右側(cè)皮層、右側(cè)基底節(jié)、左側(cè)皮層、左側(cè)基底節(jié)，另取小腦作為參照。迅速用電子分析天平（AL-104-IC型，METTLER TOLEDO，中國上海）分別稱取濕質(zhì)量（精確到0，1 mg），然后置入100 ℃恒溫干燥箱（DHG-9023型 國藥集團(tuán)上海醫(yī)療器械有限公司，中國上海）烘干24 h，取出后迅速分別稱量干質(zhì)量。通過干濕稱重法計(jì)算各腦組織標(biāo)本含水量，計(jì)算公式為：腦水含量= [ （濕質(zhì)量-干質(zhì)量） /濕質(zhì)量] ×100%。

1，7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Stata 7，0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，腦組織水含量數(shù)據(jù)及HO-1蛋白條帶像素值數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的均數(shù)比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，對(duì)比采用成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)，以P<0，05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2，1 生理學(xué)參數(shù)

本實(shí)驗(yàn)中大鼠基底節(jié)注射自體動(dòng)脈血時(shí)各項(xiàng)生理學(xué)參數(shù)：動(dòng)脈血pH、PaO2、PaCO₂、血糖值、血球壓積均大致在正常范圍（表1）。

2，2 大鼠基底節(jié)組織內(nèi)HO-1蛋白含量

WesteRn blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HBOP組大鼠基底節(jié)內(nèi)HO-1蛋白含量顯著高于假預(yù)處理組。HBOP組大鼠HO-1蛋白條帶為（2590±724）像素，是假預(yù)處理組（834±549）像素的3倍（P<0，05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBOP顯著上調(diào)了大鼠基底節(jié)組織內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)（圖1）。

2，3 腦組織水含量

HBOP+ZnPP組及假預(yù)處理+ZnPP組大鼠血腫同側(cè)基底節(jié)組織水含量分別為（82，8±0，9）%，（82，6±0，7）%，組間對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HBOP+DMSO組大鼠右側(cè)（血腫側(cè)）基底節(jié)組織水含量為（81，4±0，9）%顯著低于假預(yù)處理+DMSO組（82，6±0，8）%（P<0，05）（表2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBOP顯著減輕了大鼠ICH后腦水腫，而在預(yù)處理同時(shí)腹腔內(nèi)給與HO-1抑制劑ZnPPⅨ抵消了HBOP誘導(dǎo)的減輕腦出血后腦水腫的效應(yīng)。

3 討論

血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）是催化血紅素降解為鐵離子、一氧化碳、膽綠素的限速酶，是一種應(yīng)激蛋白[12]，在發(fā)熱、氧化應(yīng)激、缺氧與腦缺血及腦出血等應(yīng)激狀態(tài)下，可在腦內(nèi)被大量誘導(dǎo)、表達(dá)合成。研究表明，HO-1的上調(diào)表達(dá)對(duì)機(jī)體起著抗炎、抗氧化應(yīng)激、減輕細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞保護(hù)作用[13]，且在各種預(yù)處理方式誘導(dǎo)的缺血-再灌注損傷耐受現(xiàn)象中起著重要作用[8-9，14-15]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，HBOP組大鼠基底節(jié)組織內(nèi)HO-1蛋白含量顯著高于假預(yù)處理組， HBOP顯著上調(diào)了大鼠基底節(jié)組織內(nèi)HO-1的含量。實(shí)驗(yàn)中HBOP+DMSO組大鼠血腫同側(cè)基底節(jié)組織內(nèi)腦組織水含量顯著低于假預(yù)處理組+DMSO組，而HBOP+ZnPP組大鼠血腫同側(cè)基底節(jié)組織內(nèi)腦組織水含量與假預(yù)處理+ZnPP組大鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明大鼠在接受HBOP同時(shí)腹腔內(nèi)應(yīng)用HO-1特異性抑制劑泵ZnPPⅨ抵消了由HBOP誘導(dǎo)的減輕ICH后腦水腫的效應(yīng)。因此，筆者認(rèn)為，HO-1的上調(diào)是HBOP減輕大鼠腦出血后腦水腫的重要機(jī)制，HBOP通過誘導(dǎo)HO-1蛋白的上調(diào)表達(dá)起到了減輕大鼠腦出血后腦水腫的作用，體現(xiàn)出了一種保護(hù)性的效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)并未觀察HBOP對(duì)大鼠ICH后HO-1蛋白表達(dá)的影響。HO-1在ICH后腦水腫產(chǎn)生過程中所起的作用比較復(fù)雜，ICH后腦水腫產(chǎn)生的主要機(jī)制為血紅蛋白及其降解產(chǎn)物的毒性作用[3，16-18]，HO-1可被血紅素本身迅速地上調(diào)表達(dá)[19]。宮曄[7]在大鼠ICH后腹腔內(nèi)置入HO-1抑制劑ZnPP微泵顯著減輕了大鼠ICH后腦水腫。Huang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，隨著大鼠腦內(nèi)血紅蛋白的增加可使HO-1水平上調(diào)，腦內(nèi)應(yīng)用另一種HO-1抑制劑—錫原卟啉（SnPP）顯著減輕了大鼠基底節(jié)內(nèi)注射血紅蛋白引起的腦水腫，由此認(rèn)為HO-1水平的上調(diào)可以增加腦內(nèi)血紅素的降解，從而加重ICH后的腦損傷。這些又提示在ICH后HO-1的上調(diào)表達(dá)加重了ICH后的腦水腫，并產(chǎn)生損害性的作用。筆者前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣發(fā)現(xiàn)，高壓氧預(yù)處理或假預(yù)處理后大鼠在ICH后基底節(jié)內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)含量均顯著上調(diào)，但兩者差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者認(rèn)為，這與HO-1蛋白在ICH后可被血紅素本身顯著性的大幅度上調(diào)相關(guān)。本研究提示HBOP通過上調(diào)HO-1的表達(dá)起到對(duì)大鼠ICH后的保護(hù)性作用，這可能是因?yàn)镠O-1在ICH前被HBOP低幅度的上調(diào)表達(dá)從而抑制了ICH后HO-1被血紅素顯著上調(diào)時(shí)所產(chǎn)生的損害性效應(yīng)，但是其具體機(jī)制仍未完全闡明。HBOP通過何種分子生物學(xué)機(jī)制誘導(dǎo)上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)，以及HO-1如何通過受到多重影響因素調(diào)控而對(duì)腦出血后腦水腫結(jié)局的發(fā)生發(fā)展的結(jié)局起到不同影響的作用機(jī)制目前尚不明了，這些都有待于進(jìn)一步深入研究。高壓氧預(yù)處理方式相比于其他預(yù)處理方式更為安全有效，值得我們進(jìn)一步研究探索。

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（收稿日期：2013-05-13）

（本文編輯：邵菊芳）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，010

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（30672153）

作者單位：310015 杭州，杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（施振華、裘五四、王衛(wèi)民、姜啟周）；復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)外科（秦智勇）

通信作者：秦智勇，Email： wisdomqin@vip，163，com

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